Metilénkékes élesztővizsgálatok: élő sejtek számlálása vagy a légzés időmérése

Két cső áll a laborasztalon. Mindkettő kék. Az egyikben a mikroszkóp alatt látható kék sejtek elpusztult élesztőt jelentenek. A másikban a kékről színtelenre változó cső azt jelzi, hogy az élesztő él és lélegzik. Ugyanaz a festék, ellentétes értelmezés. Ha összekeverjük a két vizsgálatot, minden következtetés az ellenkezőjére fordul.

Erről a különbségről szól az egész cikk. A metilénkék redoxfesték: oxidált állapotban kék, redukált állapotban színtelen leukometilénkék. Az életképesség-számlálás ezt a kémiai tulajdonságot egy rövid mikroszkópos pillanatfelvételben használja ki. A légzési kísérlet ugyanezt egy időben követett, teljes mintatérfogatban zajló reakcióban alkalmazza. Mindkettő saját protokollt, saját kontrollokat és saját kritikus szemléletet igényel.

Az életképesség-számlálás: rövid festés, gyors értékelés

A sörfőzésben használt protokoll a leginkább szabványosított változat. Készítsünk 0.01% w/v metilénkékoldatot 2% nátrium-citrátban, keverjük 1:1 arányban az élesztőszuszpenzióval, és rövid, rögzített idő elteltével vizsgáljuk meg a keveréket. A közölt időközök a Brewing Science Institute kézikönyvében szereplő 1–2 perctől a kutatási protokollokban alkalmazott körülbelül 5 percig terjednek, míg az OIV borászati mikrobiológiai módszere 10 percen belüli vizsgálatot ír elő. A festék koncentrációja a számlálási keverékben végül közel 0.005%. Töltsünk meg egy továbbfejlesztett Neubauer-kamrát, és körülbelül 400x nagyítás mellett soroljuk a sötétkék sejteket a nem életképes, a festetleneket pedig az életképes sejtek közé. Az OIV-módszer a világoskék sejteket élőnek értékeli, ami már előrevetíti az alább tárgyalt szubjektivitási problémát.

A sejtkoncentráció a kamra geometriájából számítható ki. Ha a teljes központi, 1 mm oldalhosszúságú négyzetet megszámláljuk, az egy mL-re jutó sejtszám N szorozva a hígítási tényezővel és 10^4-nel, ahol N az ezen a területen megszámolt sejtek száma, az ASBC élesztővizsgálati módszereiben leírtak szerint. Az életképesség számítása egyszerűbb: a festetlen sejtek számát elosztjuk az összes sejt számával, majd megszorozzuk 100-zal. Az életképesség becsléséhez körülbelül 400 sejtet számoljunk meg, a FEMS sörfőzdei összehasonlító vizsgálatát és az OIV gyakorlatát követve. Következetesen alkalmazzunk egyetlen határvonalszabályt: például számítsuk be az alsó és bal oldali rácsvonalon lévő sejteket, a felső és jobb oldalin lévőket pedig hagyjuk ki.

A sarjak számlálására még a számlálás megkezdése előtt szabályt kell meghatározni. Egy elterjedt eljárás szerint a sarj külön sejtnek számít, ha eléri az anyasejt méretének körülbelül a felét; ennél kisebb méretnél az anyasejttel együtt számítjuk. Bármelyik szabályt választjuk, minden négyzetben ugyanazt alkalmazzuk, és írjuk fel a munkalapra, hogy a következő vizsgáló is így járjon el.

Számlálási munkalap (nyomtassa ki)

Ez a munkalap kifejezetten ehhez a cikkhez készült saját segédanyag. Másoljuk át egy jegyzetfüzetbe, vagy nyomtassunk ki mintánként egy példányt.

Életképesség (%) = 100 x festetlen / (festetlen + sötétkék). Összes sejt per mL = N x hígítási tényező x 10^4, ahol N a meghatározott kamraterületen megszámolt sejtek száma. Jegyezzük fel a festési időt az eredmény mellé, mert az időzítés nélkül megadott életképességi érték nem reprodukálható.

Miért változnak az életképességi értékek?

Az első zavaró tényező az időzítés, és mindkét irányban torzíthat. Az anyagcsere szempontjából aktív sejtek redukálják a festéket, így a túl korai értékelés még a redukció befejezése előtt mutathatja az élő sejteket, és tévesen elpusztultnak minősítheti őket. A hosszabb expozíció viszont önmagában is toxikus, és valóban károsodott, kék sejteket hoz létre, tévesen sejtpusztulást jelző festődést eredményezve. Egy laboratóriumi oktatási protokoll ezért 5 percen belüli értékelést ír elő, ahogyan azt a Wisconsini Egyetem élesztővizsgálati oktatási protokollja dokumentálja. A megalapozott megfogalmazás az, hogy a metilénkékes értékelés időfüggő: ezért rögzítsünk egyetlen rövid időközt, és a sorozat minden mintájánál tartsuk állandóan.

Az alacsony életképességű minták egy második torzítást is hordoznak. A szabványosított módszer figyelmeztet arra, hogy körülbelül 80% alatt a metilénkék túlbecsülheti a valódi életképességet, mert a festéket még redukáló sejtek nem feltétlenül őrzik meg szaporodási képességüket. A sörfőzési szakirodalom ugyanezt a megbízhatatlanságot írja le, amikor az életképesség jelentősen romlik. A metilénkéket gyors, közelítő becslésként kezeljük, és az alacsony életképesség esetén hozott kritikus döntéseket, például egy tenyészet újbóli felhasználását az erjesztés beoltására, erősítsük meg telepszámlálással vagy kiegészítő festéssel.

Harmadikként a mátrixhatások következnek. Az OIV-módszer körülbelül pH 4.6 mellett működik, és figyelmeztet arra, hogy az erősen pufferelt, alacsony pH-jú minták akadályozzák a festék megfelelő viselkedését. Emellett 100 g/L feletti cukortartalom esetén nem javasolja a vizsgálatot, mert a sejtek megtévesztően világoskéknek látszanak. A festési pH kísérletes összehasonlítása jelentősen eltérő érzékenységet mutatott a vizsgált tartományban, összhangban egy pH-függő metilénkékes módszert vizsgáló tanulmánnyal. A törmelék külön csapdát jelent: a szennyezett cefrék festődő részecskéi elpusztult sejteknek tűnhetnek, és növelik a vizsgálók közötti eltérést.

Ez az eltérés számszerűsített, nem csupán anekdotikus. A FEMS élesztővizsgálati összehasonlításában közölt, hat hónapos sörfőzdei vizsgálatban a két párhuzamos metilénkékes mérés átlagos szórása 6.1% volt, szemben az oxonolos áramlási citometria 0.2%-ával; két vizsgáló ugyanazon mintára adott eredménye akár 13 százalékponttal is eltért. Az életképességi módszerek 2023-as kvantitatív összehasonlítása a fluoreszcens mikroszkópiát és az áramlási citometriát lényegesen precízebbnek találta, ugyanakkor azt is kimutatta, hogy a teljesítmény a fajtól és a mátrixtól függ. Továbbra is Painting és Kirsop klasszikus módszerleírása (PMID 24430080) a viszonyítási alap, az élesztő életképességi és vitalitási vizsgálatait áttekintő szélesebb összefoglaló (PMID 25154541) pedig a metilénkéket a kiegészítő, nem pedig a végleges választ adó tesztek közé sorolja. A tripánkék itt nem jelent automatikusan előrelépést: a membrán épségének elvesztését jelzi, míg a metilénkék a festékfelvételt és a redukáló aktivitást együttesen mutatja, ezért a stressznek kitett sejtek a két festékkel eltérő besorolást kaphatnak.

A légzési kísérlet: mérjük a kék szín eltűnésének idejét

A második vizsgálatban egyáltalán nincs szükség mikroszkópra. Élesztő, glükóz és híg metilénkék kerül egy zárt csőbe, az óra pedig azt méri, mennyi idő alatt tűnik el a kék szín. A sejtek anyagcseréjük során redukáló ekvivalenseket termelnek, amelyek a kék festéket színtelen formájává alakítják, miközben az oldott oxigén visszaoxidálja azt. Amint a sejtek lecsökkentik az oxigénszintet, a nettó redukció kerül túlsúlyba, és a cső elszíntelenedik. A végpont tehát a légzés, a festékkoncentráció és az oxigén elérhetőségének egyensúlyát tükrözi. Ezért metilénkék-redukciós vagy elszíntelenedési időként kell megadni, nem pedig a molekuláris oxigén fogyasztásának közvetlen sebességeként.

Az életképességi vizsgálathoz képest jóval hígabb festéket használjunk, hogy a mért idő kényelmesen kezelhető tartományba essen. Az AQA A-level kötelező gyakorlati kézikönyve ezt jól szabványosítja: 1 g glükóz 100 mL, körülbelül 30 C-ra melegített vízben, közvetlenül felhasználás előtt hozzáadott 5 g szárított élesztő, valamint közel 0.001%-os festék-munkaoldat, amelyet 0.1 mL 1%-os törzsoldat 100 mL-re hígításával készítünk. Keverjünk össze 2 mL élesztő–glükóz-szuszpenziót 2 mL festék-munkaoldattal, hagyjuk felvenni a vizsgálati hőmérsékletet, rázzuk egyszer 10 másodpercig, indítsuk el az időmérőt, majd ne rázzuk újra. A rázás ismét oxigént juttat a mintába, és visszakékíti a csövet: ez az eljárás legnagyobb műterméket okozó tényezője. Az AQA megjegyzi, hogy a készítménynek 35 C-on általában körülbelül 5 percen belül el kell színtelenednie; a kísérleti átlagok 20 C-on 275 s, 35 C-on 128 s, 45 C-on pedig 145 s voltak. Ezek egy adott összeállításból származó példák, nem általános referenciaértékek. A redukció sebessége és az anyagcsere szempontjából aktív élesztő közötti mennyiségi kapcsolatot ellenőrzött körülmények között célzott redukciós vizsgálatok támasztják alá, köztük a PMID 25773544 azonosítóval nyilvántartott munka és a Yeast folyóiratban megjelent mechanisztikus tanulmány (2014).

Az időbeli lefolyás bemutatása (saját segédanyag)

Az alábbi táblázat ehhez a cikkhez készült saját szemléltető anyag, amely a fent leírt AQA-jellegű összeállítást használja: 2 mL élesztő–glükóz-keverék és 2 mL, közel 0.001%-os festék-munkaoldat, egyetlen 10 másodperces rázás, majd zavartalan inkubálás. A bejegyzések példaként megadott mérési értékek, abban a formátumban, ahogyan egy diákcsoportnak rögzítenie kell őket; a sebességi index definíciója 1 osztva a másodpercben kifejezett elszíntelenedési idővel. Végezzük el ugyanezekkel a csövekkel a kísérletet, és cseréljük ki a bejegyzéseket a mért értékekre.

Ábrázoljuk a sebességi indexet a hőmérséklet függvényében az A, B és C cső esetében. A görbe emelkedik, majd ellaposodik vagy csökken: ez az enzimvezérelt folyamatoktól várt mintázat, nem egyenes vonal. A D, E és F cső nem adatpont ezen a görbén. Ezek azok a kontrollok, amelyek értelmezhetővé teszik a görbét.

Kontrollok, amelyek értelmet adnak az egyes vizsgálatoknak

Minden légzési mérési sorozathoz három kísérőminta szükséges. A felforralt vagy elölt élesztő, glükóz és festék keverékének kéknek kell maradnia, igazolva, hogy a gyors redukció az élő sejtek anyagcseréjétől függ. Az élő élesztő és festék hozzáadott glükóz nélkül szubsztrátkontroll, de így is számítsunk lassú elszíntelenedésre, mivel az élesztő felhasználja endogén tartalékait. A glükóz és festék élesztő nélküli keveréke a kémiai vakminta; ez elengedhetetlen, mert a glükóz lúgos közegben sejtek jelenléte nélkül is redukálhatja a metilénkéket.

Az életképesség-számlálás másfajta kontrollt igényel: az eljárás állandóságát. Ugyanaz a festék-törzsoldat, ugyanaz a keverési arány, ugyanaz a festési idő, ugyanaz a kamraterület, ugyanazok a sarjszámlálási és határvonalszabályok, lehetőség szerint vakon végzett számlálással. Ha két vizsgáló eredménye tíz százalékponttal eltér, a munkalap rendszerint feltárja az okot: eltérő időzítés, eltérő küszöb a kéknek minősítéshez vagy eltérő sarjszámlálási szabályok. A festett sejtek előkészítésének és megfigyelésének technikái kapcsolódnak az egyszerű baktériumfestési módszerekhez, míg a mikroszkópos festési atlasz szélesebb áttekintést ad arról, mit jelöl a festék a különböző mintákban. A kék szín intenzitásának kvantitatív értékelése mögötti fizikai háttérhez a mérési körülményekkel megjelölt abszorpciós referencia magyarázza el, miért kell minden együttható mellett megadni az oldószert, a pH-t és a koncentrációviszonyokat.

A vizsgálatot a kérdéshez válasszuk. Az, hogy hány sejt él éppen most, számlálási kérdés, amelyre a mikroszkóp és egy munkalap ad választ. Az, hogy mennyire aktívan lélegzik ez a tenyészet, kinetikai kérdés, amelyre stopperórával és ellenőrzött csőmintákkal válaszolunk. A metilénkék mindkettőre alkalmas, de soha nem ugyanabban a csőben, ugyanabban az időben.