Metilénkék DNS- és RNS-festéshez: alkalmazások géleken és membránokon

Egy hallgató agarózgélt futtat, metilénkékkel megfesti, és semmit sem lát ott, ahol erős sávot várt. A szomszédos munkaállomásnál egy posztdoktori kutató ugyanabból a kék üvegből fest meg egy Northern-membránt, és három perc alatt éles riboszomális sávokat kap. A hallgató arra következtet, hogy a gélfuttatás nem sikerült. Pedig sikerült. A két feladat eltérő volt, és ugyanaz a festék más érzékenységgel, más háttérrel és a további lépésekre vonatkozó más szabályokkal ad választ rájuk.

A metilénkékes DNS- és RNS-festés kémiai alapja közös, a célja azonban nem. A gélben a festék azt jelzi, mennyi nukleinsav található egy porózus mátrixban. A membránon azt mutatja meg, hogy sikerült-e az átvitel, és egyenletes volt-e a mintafelvitel az egyes sávokban. Ha ez a különbség világos, a protokollok, a kimutatási határok és a kompatibilitási korlátok is érthetővé válnak.

A rövid válasz

A metilénkék sík szerkezetű, kationos festék, amely nem kovalensen és reverzibilisen kötődik a nukleinsavakhoz: a foszfátcsoportokhoz való elektrosztatikus vonzás, a bázispárok közé történő interkaláció és a kis árokhoz való kötődés együttesen vesz részt ebben. A lényeg éppen a reverzibilitás. A sávok megfesthetők, látható fényben dokumentálhatók, majd a festék eltávolítható, illetve a minta megtisztítható klónozáshoz, hibridizációhoz vagy újabb próbával történő vizsgálathoz.

Kettős szálú DNS agarózgélben történő metilénkékes festéséhez a szokásos gyors recept 0.02 százalék w/v (200 mikrogramm/mL) vizes oldat, körülbelül 15 perc festés, majd körülbelül 15 perc vizes festékeltávolítás, fehér fényű átvilágítón történő megtekintéssel. Membránokhoz a klasszikus Northern-blot recept 0.02–0.04 százalék festék nátrium-acetátban, pH 5.2 körüli értéken, néhány perces festéssel az átvitel és a rögzítés után, majd vizes öblítéssel és a festék teljes eltávolításával a hibridizáció előtt. Az érzékenység mérsékelt: jó körülmények között gélsávonként néhány tíz–néhány száz nanogramm, míg az óvatosabb útmutatók 0.5–1 mikrogrammot adnak meg. Ez nagyságrendekkel több, mint az etídium-bromid és a SYBR-festékek esetében. Membránokon nincs egyetlen, általánosan használható kimutatási határ egy adott transzkriptre, mert a festék főként a nagy mennyiségben jelen lévő riboszomális RNS-t és a felvitt anyag összmennyiségét mutatja. Egyik receptben se helyettesítse a festéket kereskedelmi forgalomban kapható étrend-kiegészítő oldattal. A validált módszerek analitikai tisztaságú festéket, pontosan meghatározott puffereket és RNS esetén RNáz-mentes munkavégzést feltételeznek.

Hogyan működik a kötődés, és hol vezethet félre?

A jól használható modell három részből áll. Először is a pozitív töltésű gyűrűrendszert vonzza a negatív töltésű foszfátgerinc. Spektroszkópiai vizsgálatok szerint alacsony sókoncentráció mellett ez az elektrosztatikus kölcsönhatás dominál, míg a modellezés és a molekuladinamikai vizsgálatok az interkalációt és a kis árokhoz való kötődést is stabil kötődési módként azonosítják kettős szálú DNS esetén, amint azt a metilénkék DNS-hez való kötődésének spektroszkópiai vizsgálata összefoglalja. Másodszor, bizonyos GC-preferencia megfigyelhető: a modellezés a CpG és GpC lépéseket részesíti előnyben, a kísérletek pedig GC-gazdag duplexekhez való preferenciális kötődést jeleznek a metilénkék interkalációs preferenciáit vizsgáló munkában, de az AT-duplexek is megkötik a festéket. A rutinszerű festés nem szekvenciaspecifikus. Harmadszor, az egyszálú DNS és az RNS főként elektrosztatikus kölcsönhatások, valamint a hozzáférhető bázisokkal és duplex régiókkal kialakuló rétegződés révén kötődik, ezért a festődés erőssége a hossztól, a szekvenciától és a másodlagos szerkezettől is függ.

Ebből két következmény adódik. Mivel a kötődés nem kovalens, a festék kimosódik. A poliakrilamid-sávok gyorsan elhalványulnak, ha nem rögzítik őket külön; kifejezetten tartós rögzítést biztosító változat éppen azért létezik, mert a szokásos festés átmeneti, ahogyan azt Soto és Draper PAGE-gélekre vonatkozó munkája leírja. Mivel a festék fotoszenzibilizátor, a festett DNS tartós, erős megvilágítása oxigén jelenlétében oxidálhatja a guanint, és idővel egyszálú töréseket okozhat; ezt a mechanizmust a metilénkék által érzékenyített guaninoxidációról szóló munka részletezi. A rövid idejű, fehér fényben történő megtekintés elkerüli a klasszikus etídium-bromidos munkafolyamatok jól ismert UV-károsító hatását, és ez valódi előny a preparatív kinyerésnél. A látható fény kíméletesebb, de nem ártalmatlan. Ha a DNS-t klónozni fogja, tartsa röviden a megvilágítás idejét. Az óvatosság mögött álló tágabb fotokémiai háttérről lásd a metilénkék fotokémiájának két reakcióútját. Az oxidált forma kötődését és a redukált forma kötődésének hiányát magyarázó redoxpárról és töltésállapotokról lásd a metilénkék szerkezetének és tulajdonságainak kémiáját.

Első feladat: festés gélekben

A gélfestés egy kérdésre ad választ: van-e elegendő nukleinsav ebben a sávban ahhoz, hogy szabad szemmel látható legyen? A legjobban jellemzett eset a kettős szálú DNS agarózban. Flores és munkatársai eredeti metilénkékes gélfestési módszere 1 százalékos agarózon validálta a 0.02 százalékos gyors protokollt, és igazolta az ezt követő sikeres kinyerést és klónozást. Ugyanez a beszállítói protokoll szerepel az IBI Scientific metilénkék-termékoldalán, ahol a 0.04 százalékos membránfestési receptet és a gyors gélfestési változatot egymás mellett ismertetik.

Gyakorlati munkafolyamat:

1. Futtassa a gélt a szokásos módon. Az elektroforézis után fessen, ne közben, kivéve, ha a módosított módszerhez validálták az átvitelt vagy a felbontást.
2. Merítse a gélt desztillált vízben készített 0.02 százalék w/v metilénkékoldatba, és finom mozgatás mellett fesse körülbelül 15 percig.
3. Távolítsa el a festéket többszöri vízcserével, összesen körülbelül 15 perc alatt, amíg a mátrix háttérszíneződése csökken, és a sávok kiemelkednek.
4. Haladéktalanul fényképezze le fehér fényű átvilágítón.

Az agaróz és a poliakrilamid eltérően viselkedik. Az agaróz visszatartja a festéket a mátrixban, ezért a festékeltávolítás a lassú lépés. A vékony poliakrilamidgélek gyorsan megfestődnek, de gyorsan el is veszítik a festéket, ami segíti a preparatív kivágást, viszont megnehezíti az archiválható dokumentálást. A poliakrilamidban lévő szintetikus oligonukleotidok ugyanazzal a 0.02 százalékos recepttel, ismételt vizes mosásokkal 20–30 perc alatt láthatóvá tehetők a bevált, Current Protocols jellegű PAGE-módszereket követve. Preparatív oligonukleotidokhoz híg TBE-ben, körülbelül 0.0002 százalékos koncentrációval, többórás festéssel végzett változatokról is beszámoltak, de ezek bizonyítékalapja gyengébb.

Fontos, hogy DNS-ről vagy RNS-ről van-e szó. A kettős szálú DNS biztosítja a legerősebb, szerkezethez kötött kölcsönhatást. Az RNS és az egyszálú DNS is festődik, de gyengébben és kevésbé kiszámíthatóan. Formaldehides agaróz RNS-géleknél a legtöbb laboratórium kihagyja a gélen belüli kék festést, és előbb membránra viszi át az RNS-t, majd ott festi meg. Ezzel a gyenge géljelet élesebb membránjelre cseréli, és a mintafelvitelről is dokumentációt kap.

Második feladat: festés membránokon

A membránfestés más kérdésre ad választ: sikerült-e az átvitel, és összehasonlíthatók-e az egyes mintasávok? A klasszikus alkalmazás Herrin és Schmidt reverzibilis Northern-blot festése, amely eredetileg 0.04 százalékos festéket alkalmazott 50 mM nátrium-acetátban, pH 5.0 mellett, 2–3 percig, vizes öblítéssel; a festék hibridizáció előtt SSPE-ben készített híg SDS-oldattal eltávolítható.

A széles körben használt modern változat lépései:

1. Vigye át az RNS-t vagy a denaturált DNS-t nejlonra vagy nitrocellulózra, majd rögzítse UV-keresztkötéssel vagy hőkezeléssel, hogy a minta ne vesszen el a festés során.
2. Nem kötelező, de gyakori lépés: nedvesítse a membránt 5 százalékos ecetsavban körülbelül 15 percig.
3. Fesse 5–10 percig 0.02–0.04 százalékos metilénkékoldatban, 0.3–0.5 M nátrium-acetátban, pH 5.2 körüli értéken.
4. Öblítse, és távolítsa el a festéket vízben 5–15 percig, dokumentálja, majd a hibridizáció előtt távolítsa el a maradék festéket.

A Northern-vizsgálatokban a pozitív töltésű nejlon a legelterjedtebb. A nitrocellulóz is használható ugyanazzal az ecetsavas és acetátos munkafolyamattal. A kép az átvitel ellenőrzésére, a 28S és 18S sávok összehasonlítására (bakteriális RNS esetén a 23S és 16S sávokéra), a méretmarkerek és standardok megjelölésére, valamint az össz-RNS alapján történő közelítő normalizálás dokumentálására szolgál. Publikált Northern-módszerek a festett riboszomális sávok mennyiségi értékelésével ellenőrzik a mintafelvitelt; ilyen az a tejtudományi munka is, amely metilénkékkel festett riboszomális sávokat használt normalizálásra. A Southern-membránok ugyanígy láthatóvá tehetők, de a festék jóval bevettebb a Northern-mintafelvitel és -átvitel ellenőrzésére. Emellett a Southern-vizsgálathoz használt DNS-t átvitel előtt denaturálják, így a gélekre megadott érzékenységi értékek nem alkalmazhatók közvetlenül.

Kimutatási határok és háttér: ahol a kék festék alulmarad

Az alábbi összehasonlítás szándékosan közelítő. A festés teljesítménye a gél százalékos koncentrációjától, a sáv szélességétől, az optikától és a festékeltávolítás gondos végrehajtásától függ. Minden számot nagyságrendi becslésként kezeljen, ne specifikációként.

A háttér megfelelő csökkentése dönti el, hogy a mérsékelt jel használható-e. A szabad festék intenzíven színezett, ezért a kontrasztot a nem kötött festék eltávolítása teremti meg úgy, hogy közben a kötött festék megmaradjon. A töményebb festék ritkán növeli az érzékenységet. Főként a festékeltávolítás idejét hosszabbítja meg. Vizsgáljon hígítási sort pontosan az adott géllel, membránnal és kamerával, és csak azt a tartományt használja, amelyben az integrált denzitás arányos marad a bevitt mennyiséggel. A metilénkék alkalmas a mintafelvitel félkvantitatív normalizálására. Nem nagy dinamikatartományú kvantitatív vizsgálat, mert a membrán kapacitása, az átvitel hatékonysága, a telítődés és a festékeltávolítás mintasávonként eltér.

Kompatibilitási korlátok: mi marad használható a festés után?

A kék festést követő klónozás működését igazolták. Flores és munkatársai kivágták a festett agarózsávokat, kinyerték a DNS-t, majd ligálást és transzformációt végeztek; jobb klónozási eredményről számoltak be, mint az etídium-bromidos, UV-fényt alkalmazó eljárás után. Ennek valószínű oka a kisebb fénykárosodás, nem magának a festéknek valamilyen előnye. Tartsa röviden a fehér fénynek való kitettséget, és a kinyert DNS-t tisztítsa meg szokásos gélből történő extrakciós eljárással.

PCR-re és szekvenálásra kevesebb bizonyíték áll rendelkezésre. A maradék festék kötődik a nukleinsavakhoz, ezért az enzimatikus lépések előtt távolítsa el a festéket, és tisztítsa meg a mintát. A kék festésű gélből megfelelően tisztított DNS várhatóan használható, de a polimerázok és a szekvenálási eljárások közvetlen festékátvitellel szembeni tűrését nem számszerűsítették kellően. Ezt ne vegye adottnak.

A blothibridizáció kompatibilis, ha a sorrendet szigorúan betartják: átvitel, rögzítés, festés, dokumentálás, festékeltávolítás, hibridizáció. Ez a Herrin és Schmidt által kialakított sorrend. Az átvitel előtti festés vagy a festékeltávolítás kihagyása más módszernek számít, és külön validálást igényel. A festék eltávolítása után a próba szokásos eltávolítása és az újabb próbával történő vizsgálat a megszokott módon végezhető. Az ugyanebbe a festékcsaládba tartozó festékek sejtszintű alkalmazásáról, valamint arról, hogy a fixált keneteknél követett megközelítés miért nem vihető át az élősejtes módszerekre, lásd a mikroszkópos festési atlaszt.

A sávkivágás preparatív agarózgélek és kék festékkel azonosított PAGE-oligonukleotidok esetén is működik, feltéve, hogy nem alkalmazzák a tartós rögzítési változatot. Reverzibilisen kötődő festék esetén a festékeltávolítás utáni elektroelúció kémiailag észszerű, de a kifejezetten metilénkékre vonatkozó, ellenőrzött hozamadatok szűkösek. Elúció után végezzen sómentesítést vagy kicsapást.

Visszatérő hibák

A halvány gélsávok általában azt jelentik, hogy a kolorimetriás festéshez túl kevés az anyag, különösen rövid egyszálú vagy RNS-célmolekulák esetén. Vigyen fel több mintát, használjon friss festéket, a koncentráció növelése előtt hosszabbítsa meg a festési időt, és állítsa le korábban a festékeltávolítást. Az egyöntetűen kék, kontraszt nélküli gél általában túlfestést vagy túl kevés vízcserét jelez. A PAGE-sávok halványulása a várható kémiai viselkedés része, nem sikertelen festés. Fényképezzen gyorsan. Az egyenetlen membránháttér gyűrődésekre, buborékokra, ujjlenyomatokra, egyenetlen mozgatásra vagy foltos átvitelre utal. Hibridizációs kontroll nélkül ne értelmezze ezt egyenlőtlen mintafelvitelként. Az elmosódott, gyenge riboszomális mintázat jelenthet degradációt, de okozhatja hiányos átvitel, túl kevés össz-RNS (a szokásos mintasávok néhány–néhány tíz mikrogrammot tartalmaznak) vagy túlzott festékeltávolítás is. A festék a nagy mennyiségben jelen lévő riboszomális RNS-t mutatja. Nem egy meghatározott transzkriptet jelez. Ez a próba feladata.

Biztonság és kezelés túlzó állítások nélkül

A metilénkék kezelése egyszerűbb, mint az etídium-bromidé, de nem ártalmatlan. A MilliporeSigma aktuális biztonsági adatlapja a festéket akut orális toxicitás szempontjából a 4. kategóriába sorolja: lenyelve ártalmas, és a Sigma-Aldrich metilénkék-biztonsági adatlapja szerint jóváhagyott hulladékkezelési útvonalon kell ártalmatlanítani. Az etídium-bromidra erősebb genotoxicitási figyelmeztetések vonatkoznak, köztük a csírasejtekre gyakorolt feltételezett hatások az etídium-bromid Sigma-Aldrich biztonsági adatlapján. Géljeit és oldatait rendszerint elkülönítve, veszélyes vegyi hulladékként kezelik, amint azt a Thermo Fisher nukleinsavfesték-útmutatója is jelzi. Mindkét anyagnál kövesse a biztonsági adatlapot és az intézményi szabályokat. A száraz festéket tartsa szorosan lezárva és szárazon; a munkaoldatot csak a protokoll által megengedett módon használja újra; a festett membránokat szárazon, szűrőpapírlapok között tárolja; a géleket pedig fényképezze le, mielőtt a sávok diffúzió miatt elmosódnak.

Jegyezze meg a laborasztalnál is hasznos összefoglalást. A gélek nagy mintamennyiségnél, fehér fényben a láthatóságot vizsgálják. A membránok az átvitelt és a mintafelvitelt ellenőrzik, mielőtt a próba elvégzi az érzékeny kimutatást. Egyetlen festék szolgálja mindkettőt, mérsékelt érzékenységgel, reverzibilis kötődéssel és a műveletek szigorú sorrendjével.