Az E. coli és más telepek megjelenésének értelmezése EMB-agaron

Egy hallgató ismeretlen mintát széleszt eozin-metilénkék agarra, egy éjszakán át inkubálja, majd másnap zöldesen csillogó, sötét telepeket talál a lemezen. A jegyzőkönyvi bejegyzés így szól: „E. coli, megerősítve.” Ez a bejegyzés többet állít, mint amennyit a lemez alátámaszt. A lemez adott körülmények között megfigyelt növekedési és fermentációs fenotípust mutat. A fajazonosság külön állítás, amelyhez külön bizonyíték szükséges.

Ez az útmutató az EMB-agaron kapott eredményeket értelmezési feladatként kezeli. Elmagyarázza az alapelvet, kontrollokkal együtt mutat be egy szemléltető lemezatlaszt, és megnevezi azokat az eseteket, amikor a tankönyvi kép félrevezető.

A lemez működésének alapelve

Az EMB-agar egyszerre szelektív és differenciáló táptalaj. Az eozin Y és a metilénkék festék sok Gram-pozitív mikroorganizmust gátol, így a táptalaj a Gram-negatív mikroorganizmusok növekedésének kedvez. Ugyanezek a festékek indikátorként is működnek: amikor egy mikroorganizmus fermentálja a rendelkezésre álló cukrot, és helyileg elegendő savat termel, a telep nagy mennyiségű festéket vesz fel, és sötétlilától kékesfeketéig terjedő színt ölt. Erőteljes savtermelés esetén a telep felszínén fémes zöld irizálás jelenhet meg. Az ASM eozin-metilénkék agarlemezekre vonatkozó protokollja ismerteti a szelekció és a differenciálás ezen kombinációját, és oktatási célú referenciafotókat is tartalmaz.

Bármely eredmény értelmezése előtt fontos egy részlet: ellenőrizze, melyik összetételű táptalajt használják. A régebbi Holt Harris Teague összetétel laktózt és szacharózt is tartalmaz, míg a Levine EMB csak laktózt. A szacharózt fermentáló, de laktózt nem fermentáló mikroorganizmusok, például sok Serratia marcescens izolátum, eltérően jelenhetnek meg a két változaton. Az EMB-táptalajok gyártói dokumentációja kifejezetten rögzíti ezt az összetételbeli különbséget. Az eredmény mellett jegyezze fel a gyártót és a táptalaj összetételét is a jegyzőkönyvben.

Az elkészített, be nem oltott EMB-agar jellemzően vörösesbarna vagy vöröseslila, esetenként zöldes árnyalattal vagy finom csapadékkal. Ez a háttérszín nem jelent növekedést. Minden leolvasáskor hasonlítsa össze a látottakat egy be nem oltott lemezzel vagy a dokumentált kiindulási állapottal, és az elsődleges lemezt körülbelül 18–24 órás, 35–37 C hőmérsékleten végzett aerob inkubálás után értékelje, hacsak az oktatási protokoll másként nem rendelkezik. A hosszabb inkubálás megváltoztathatja a fermentáció megjelenését.

A lemez vizsgálata

Használjon kétféle megvilágítást. Először visszavert vagy ferde beesésű fényben vizsgálja a lemezt, és billentse meg: a fémes csillogás irizáló, ezért a látószögtől függően megjelenhet vagy eltűnhet. Ezután áteső fényben vizsgálja meg a telepek színét és sötét közepét. Jól elkülönült telepekből induljon ki, mert a zsúfoltság és a szomszédos telepek megváltoztatják a helyi savfelhalmozódást, és gyengíthetik vagy felerősíthetik a színt. Az ASM képgyűjteménye ezt közvetlenül szemlélteti: vegyes tenyészetben az E. coli elveszítheti a várt csillogását, mert a környező mikroorganizmusok megváltoztatják a savas környezetet.

Amikor a gyakorlat lehetővé teszi, használjon kontrollokat. Egy gyakori oktatási kontrollkészletben az E. coli ATCC 25922 szolgál a kékesfekete szín és a fémes csillogás fenotípusának ellenőrzésére, egy nem fermentáló mikroorganizmus, például a Salmonella Typhimurium ATCC 14028 vagy a Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 a színtelen fenotípus ellenőrzésére, egy Gram-pozitív mikroorganizmus, például az Enterococcus faecalis vagy a Staphylococcus aureus pedig gátlási kontrollként, az EMB-táptalajok szabványos minőségellenőrzési táblázataiban felsoroltak szerint. Ha a pozitív kontroll nem csillog, előbb az inkubálást, a zsúfoltságot vagy az összetételt gyanítsa, ne az ismeretlen mintát.

Szemléltető lemezatlasz

Az alábbi lemezek generált illusztrációk, nem valódi tenyészetekről készült fényképek. A keresendő mintázatot mutatják, nem egy adott törzs pontos színárnyalatát. Hasonlítsa össze őket az ASM referenciafotóival és az oktatólaboratórium valódi lemezeivel.

1. lemez: Escherichia coli EMB-agaron, erőteljes laktózfermentáló

Az E. coli EMB-agaron jellemzően sötétlila vagy kékesfekete telepeket képez, gyakran sötét középpel és az erőteljes savtermelésből eredő fémes zöld csillogással. A csillogás az a közismert jel, amelyet a hallgatók keresnek, de ezt támogató bizonyítékként, ne meghatározó ismérvként kezelje. A csillogás intenzitása a törzstől, az inkubálási időtől, a telepsűrűségtől és a látószögtől függ. A csillogás hiánya nem zárja ki az E. coli jelenlétét, a csillogás nélküli sötét telep pedig több más fermentáló mikroorganizmusra is utalhat. Minden további vizsgálathoz jól elkülönült telepet válasszon, ne zsúfolt terület alapján értékeljen.

2. lemez: Klebsiella pneumoniae EMB-agaron, nyálkás telepeket képző fermentáló

A Klebsiella pneumoniae EMB-agaron jellemzően nagy, fénylő, nyálkás telepeket képez rózsaszínes-lilától barnásliláig terjedő árnyalatokban, gyakran sötét középpel, de rendszerint erős fémes csillogás nélkül. Hasonló morfológia figyelhető meg rokon fermentálóknál, például az Enterobacter esetében. A nyálkás jelleg és a telepméret is része az értékelésnek: egy kicsi, lapos rózsaszín telep más jelentőséggel bír, mint egy nagy, domború, nyálkás telep. Az E. coli esetéhez hasonlóan a lemez fermentációs fenotípusra utal, a fajszintű azonosításhoz pedig az alább ismertetett biokémiai megerősítés szükséges.

3. lemez: Salmonella EMB-agaron és más nem fermentálók, színtelen telepek

A Salmonella és a többi laktózt nem fermentáló mikroorganizmus, köztük a Shigella és számos Pseudomonas izolátum, EMB-agaron jellemzően színtelen, áttetsző vagy halvány borostyánszínű telepeket képez. Egyes összetételek és körülmények halvány rózsaszínes árnyalatot eredményeznek, ezért egy halvány rózsaszín telep nem jelent automatikusan fermentáló mikroorganizmust. Az EMB nem különíti el a Salmonellát a Shigellától vagy más nem fermentálóktól; ezt a későbbi vizsgálatoknak kell eldönteniük. Azt is vegye figyelembe, hogy dokumentáltak már laktózpozitív Salmonella törzseket, amelyek az E. coli telepeihez hasonló fémes csillogású telepeket képeztek; ez is indokolja, hogy egyetlen lemez alapján nem zárható le az azonosítás.

4. lemez: Serratia marcescens és az összetétel csapdája

A Serratia marcescens külön szakaszt érdemel, mert a hallgatók gyakran vörös telepekre számítanak, majd félreértelmezik a lemezt. A legtöbb klinikai izolátum nem fermentálja a laktózt, ezért Levine EMB-agaron rendszerint halvány vagy gyengén színezett telepeket képez. Mivel sok izolátum fermentálja a szacharózt, a szacharózt tartalmazó összetétel sötétebb megjelenést vagy erősebb savtermelésre utaló reakciót eredményezhet. A jellegzetes vörös prodigiozin pigmentre se számítson 35–37 C hőmérsékleten; a pigmenttermelés inkubátor-hőmérsékleten nem megbízható. Amikor a protokoll a Serratia marcescens EMB-agaron mutatott megjelenését említi, ellenőrizze, milyen összetételt feltételez az állítás. A Serratia anyagcseréjéről szóló áttekintés összefoglalja a csapda hátterében álló laktóznegatív és változó szacharózfermentációs mintázatot.

5. lemez: kontrollok és gátolt mikroorganizmusok

A Gram-pozitív mikroorganizmusok, például a Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus és Bacillus növekedését az EMB-agar általában gátolja vagy jelentősen visszaszorítja, bár a gátlás nem minden törzs esetében teljes. A kontrollsor biztosítja a megalapozott értékelést: az E. coli kontrollnak jó növekedést, kékesfekete színt és csillogást kell mutatnia, a nem fermentáló kontrollnak színtelen telepeket kell képeznie, a gátlási kontrollnál pedig csekély növekedés vagy a növekedés hiánya várható. Ha a gátlási kontroll jól növekszik, a szelekció nem működött, és az adott tételen kapott minden más eredmény is kétséges. A festési módszerek más kérdésre adnak választ, mint a tenyésztéshez használt táptalajok; a tárgylemezes festés laboratóriumi oldaláról a metilénkék-festési atlaszban olvashat.

Összehasonlítás az értelmezés korlátaival

Három mondat foglalja össze a félrevezető megjelenéseket. A sötét szín nem jelent E. colit, mert a Klebsiella, az Enterobacter és más fermentálók is kialakíthatnak sötét közepű telepeket csillogás nélkül. A rózsaszín nem jelent Klebsiellát, mert a közepes intenzitással vagy lassan fermentálók, valamint egyes névleg nem fermentálók is megjelenhetnek rózsaszín vagy levendulalila telepekként. A csillogás nem jelent bizonyított E. colit, mert más erőteljes fermentálók is létrehozhatják. Az oktatási protokoll és annak vegyes tenyészeteket bemutató ábrái mindegyik ilyen téves következtetést szemléltetik.

A megerősítés korlátai

Az EMB-agar fenotípusról ad információt, nem fajról. Különböző mikroorganizmusok telepei azonos megjelenésűek lehetnek, és ugyanaz a mikroorganizmus is eltérhet a tankönyvi képtől a törzs, a kor, a zsúfoltság, az összetétel és az inkubálás függvényében. Ezért az oktatási és klinikai munkafolyamatok az EMB-n megfigyelt morfológiát csak előzetes azonosításra alkalmasnak tekintik.

Egy szakmailag megalapozott hallgatói munkafolyamat a következő: írja le az elkülönült telepet (méret, szín, közép, csillogás ferde beesésű fényben, nyálkás jelleg), rögzítse a táptalaj összetételét, az inkubálási időt és hőmérsékletet, valamint a kontrollokat; majd bármely megerősítő vizsgálat előtt egy jól elkülönült telepből átoltással hozzon létre tiszta tenyészetet. A gyakori további vizsgálatok közé tartozik a Gram-festés és az IMViC-reakciók az E. coli és a koliformok előzetes azonosítására, a TSI vagy KIA, valamint mikroorganizmus-specifikus biokémiai vizsgálati panelek az enterális mikroorganizmusokhoz, továbbá szerológiai, MALDI TOF vagy más validált azonosítás, ha a feladat megköveteli. Ha háttérinformációt keres arról, hogyan illeszkedik az EMB a szelektív és differenciáló enterális táptalajok közé, tekintse át az enterális tenyésztő táptalajok bevezető ismertetéseit és a Gram-festéssel végzett további vizsgálatot. Arra a kapcsolódó kérdésre, hogy mit bizonyíthat és mit nem egy kék tárgylemezfestés, a metilénkék-festési atlasz ugyanebben a szellemben, a megfigyelést és a következtetést különválasztva ad választ.

Előbb a megfigyelést írja le, és csak utána a következtetést. A „Sötét kékesfekete telepek a látószögtől függő zöld csillogással Levine EMB-agaron 24 óra után, ami összhangban van az erőteljes laktózfermentációval” megfogalmazás megalapozott. Az „E. coli, megerősítve” állításhoz szükség van arra a megerősítő lépésre, amelyet a lemez önmagában nem biztosít.