Èske ble metilèn ka kontoune Konplèks III mitokondri a? Poukisa etid yo pa dakò

De laboratwa te mande si ble metilèn ka kontoune yon Konplèks III mitokondri ki bloke. Youn te reponn non. Lòt la te reponn wi. Toude te gen done.

Premye etid la, sou mitokondri sèvo sourit, te jwenn koloran an pa kapab fè sa. Dezyèm lan, sou mitokondri sèvo twa espès wonjè, te jwenn li kapab fè sa an pati. Yo souvan site yon twazyèm etid, sou fwa sourit, ansanm ak yo, men li te teste yon lòt bagay. Mete l nan kontèks pa li, epi mwatye konfizyon an disparèt.

Pa gen okenn mekanis inivèsèl pou anonse. Gen twa eksperyans ki gen diferan ajan blokaj, dòz ak mezi. Li kondisyon yo an premye. Konklizyon yo vini apre.

Sa kontounman vle di isit la

Elektwon antre nan chèn lan atravè Konplèks I (soti nan NADH) oswa Konplèks II (soti nan siksinat), pase nan Konplèks III pou rive nan sitokwòm c, epi pase nan Konplèks IV pou rive nan oksijèn. Gradyan ki fòme sou wout la se sa selil la itilize pou fè ATP.

Lè yon moun deklare gen kontounman, sa vle di ble metilèn pran elektwon anvan yon blokaj epi depoze yo apre li. Koloran ki okside a pran elektwon nan NADH oswa nan premye konpozan chèn lan, epi li tounen lekometilèn ble; fòm redui a bay sitokwòm c elektwon yo oswa remete yo nan chèn lan. Si transfè a rive apre blokaj la, respirasyon ak potansyèl manbràn lan retabli an pati. Si li rive nan nivo blokaj la oswa anvan li, anyen pa retabli.

Yon detay nan Konplèks III detèmine anpil nan dezakò sa a. Konplèks la fonksyone ak yon sik Q ki gen de sit pou inibitè. Antimisin mare nan sit Qi a. Miksotyazòl mare nan sit Qo a. Yon etid ki sèvi ak youn sèlman teste sèlman mwatye konplèks la.

Premye etid: pa gen kontounman nan mitokondri sèvo sourit

Gureev ak kòlèg li yo te itilize mitokondri ki soti nan kòtèks sourit C57BL/6, yo te izole ak dijitonin epi teste a 0.1 mg pwoteyin pa ml. Sibstra yo te kouvri twa rejim: pirivat ak malat a 5 mM chak, siksinat a 10 mM ak glitamat a 2 mM, epi L-pwolin a 10 mM. Ajan blokaj yo te wotenòn a 1 micromolar (Konplèks I) ak antimisin a 1 microgram pa ml (Konplèks III). Dòz koloran yo te 0.5, 1, ak 2 micromolar, ak 1 micromolar kòm konsantrasyon prensipal la. Metòd yo ak tras anrejistreman yo nan kominikasyon FEBS Letters la.

Kontounman Konplèks I te mache. Wotenòn te fè respirasyon ADP estimile a desann soti nan anviwon 121 rive nan anviwon 2 nmol pa minit pa mg, epi koloran a 1 micromolar te fè l remonte nan anviwon 21. Potansyèl manbràn lan te retabli ak pirivat ansanm ak malat, epi ak L-pwolin.

Kontounman Konplèks III pa t mache. Antimisin te fè respirasyon an desann nan anviwon 16, epi koloran an te fè l monte sèlman nan anviwon 20. Potansyèl manbràn lan pa t retabli ak okenn sibstra, menm ak dòz koloran jiska 5 micromolar. Done sou pewoksid yo te ale nan menm sans lan: koloran an poukont li te fè emisyon pewoksid monte soti nan yon vitès debaz toupre 76 pmol pa minit pa mg rive nan anviwon 1170, 1460, ak 1945 pou twa dòz yo, men antimisin te redui siyal koloran an te pwodui a pa anviwon 25, 88, ak 96 pousan respektivman. Si koloran redui a te reyaji dirèkteman ak oksijèn, bloke Konplèks III pa ta dwe diminye siyal la. Otè yo te dedui koloran redui a okside nan sit Qo Konplèks III a, anvan blokaj antimisin lan. Men sik kout la an mo: donè yo bay koloran an elektwon, koloran an bay Qo yo, epi wout nòmal la kontinye. Wotenòn kontoune. Antimisin pa kontoune.

Dezyèm etid: kontounman pasyèl nan twa espès, nan toude sit inibitè yo

Svab ak kòlèg li yo te elaji konsepsyon eksperyans lan. Yo te sèvi ak mitokondri sèvo sourit, rat ak kochon Gine, yo te izole ak Percoll epi teste nan menm konsantrasyon 0.1 mg pa ml la, ak pirivat ansanm ak malat oswa glitamat ansanm ak malat a 5 mM chak. Yo te itilize de ajan blokaj Konplèks III: antimisin A a 0.3 micromolar ak miksotyazòl a 1 micromolar. Koloran an te a 2 micromolar nan pifò tès yo, epi a 0.5 nan travay sou sitokwòm c a. Done sou tout twa espès yo, ak pwotokòl ki koresponn, nan atik ki gen aksè lib la.

Toude blokaj yo te kontoune an pati, nan tout twa espès yo. Nan mitokondri sourit, antimisin te diminye respirasyon an epi koloran an te ogmante l anviwon 60 pousan, soti nan apeprè 37 rive nan 59 nmol pa minit pa mg. Miksotyazòl te diminye l 88 pousan, pou l rive nan anviwon 4.5, epi koloran an te fè l monte senk fwa pou l rive nan anviwon 23. Potansyèl manbràn lan te repolarize an pati anba youn oswa lòt inibitè a; yo te mezire l ak de koloran (safranin O ak TMRM ratyometrik) pou elimine atifak optik.

Atik sa a te teste transfè a dirèkteman tou, yon bagay premye etid la pa t janm fè. Mitokondri ki te gen enèji pa t redui sitokwòm c asetile yo te ajoute soti deyò a 25 micromolar, kit te gen inibitè kit pa t genyen, men lè yo te ajoute koloran an, rediksyon an te fèt nan toude ka yo. Nan yon solisyon tanpon san selil, NADH ansanm ak koloran te redui sitokwòm c nan yon vitès ki te pwopòsyonèl ak NADH. Men so ki pi long lan an mo: ekivalan rediktè yo ale nan koloran an, koloran an bay sitokwòm c yo dirèkteman, epi Konplèks IV pase yo bay oksijèn. Wout sa a evite Konplèks III nèt, kidonk li posib pou kontoune toude ajan blokaj yo.

De lòt mezi soutni entèpretasyon sa a. Fliyoresans NAD(P)H te bese lè yo te ajoute koloran nan mitokondri ki te trete ak miksotyazòl, sa ki vle di ekivalan rediktè yo t ap koule nan nouvo wout la. Epi absòbans koloran an a 660 nm te swiv chak adisyon youn apre lòt, pandan sipènatan yo te jwenn apre santrifigasyon te montre koloran okside a t ap akimile plis pase yon santèn fwa andedan mitokondri ki te gen enèji, epi li t ap soti lè potansyèl la te tonbe. Bilan pwoton yo koresponn tou: lè wout la evite etap ponpaj yo, li rete apeprè 2 pwoton pou chak pè elektwon olye de 10. Kidonk, yon itilizasyon oksijèn ki pi rapid ak sèlman yon repolarizasyon pasyèl se sa yon kontounman reyèl bay, se pa yon prèv kont li.

Menm preparasyon an te bay repons ki ka twonpe moun ki li twò vit. Avèk inibitè ansanm ak koloran, ADP te diminye respirasyon an olye li te ogmante l, epi blokaj transpò te estimile l olye li te ralanti l, pandan potansyèl manbràn lan te toujou chanje nan sans nòmal yo. Konsomasyon oksijèn poukont li twonpe nan sistèm sa a.

Twazyèm etid: etid sou fwa ki te teste Konplèks I ak II, pa III

Lee ak Boelsterli te itilize mitokondri fwa sourit ak epatosit an kilti ki te domaje ak efavirenz (Konplèks I, IC50 toupre 30 micromolar) ak idrazin, metabolit izonyazid la (Konplèks II, IC50 toupre 30 micromolar). Koloran a anviwon 30 micromolar te retabli oksidasyon NADH, potansyèl manbràn lan ak ATP, pandan li te diminye oksidan ak lanmò pa nekwoz. Atik Redox Biology a prezante sa nan yon modèl kote koloran an pote elektwon pou kontoune Konplèks I ak II ki domaje yo.

Rezilta sa a se yon kontèks etabli pou pati ki pi bonè nan chèn lan, epi li pa di anyen sou Konplèks III paske pa t gen anyen ki te bloke la. Li pa ka konfime ni demanti okenn nan etid sou sèvo yo.

Matris kondisyon yo

Kat rezon toude etid sou Konplèks III yo ka gen rezon pou pwòp konfigirasyon pa yo

1. Ajan blokaj la pa t menm entèvansyon an. Antimisin sèlman a 1 microgram pa ml, kont antimisin a 0.3 micromolar ak yon ajan apa ki bloke sit Qo a. Yon wout koloran ki voye elektwon nan sit Qo a echwe egzakteman kote yon wout ki ale dirèkteman nan sitokwòm c reyisi. Yon sèl sit pa ka reprezante toude.

2. Dòz koloran an ak moman mezi yo te diferan. Konsantrasyon prensipal 1 kont 2 micromolar, pou yon ajan ki fè sik redoks epi ki gen absòpsyon ak rediksyon dirèk sitokwòm c ki depann de konsantrasyon ak tan. Ti diferans nan dòz ansanm ak diferan moman mezi ka mete diferan branch menm rezo a an evidans.

3. Preparasyon yo te diferan. Izolasyon ak dijitonin kont izolasyon sou gradyan Percoll chwazi popilasyon mitokondri ki gen kèk eleman an komen, men ki pa idantik. Konsantrasyon pwoteyin lan te menm, a 0.1 mg pa ml, kidonk varyab sa a pa antre nan diferans lan, men soupopilasyon ak entegrite yo toujou antre ladan l. Epi yo te elimine espès la kòm sous sispèk la: dezyèm gwoup la te repwodui fenotip li a nan sourit tou.

4. Eta sibstra a detèmine sa koloran an ka fè. Twa rejim sibstra kont pè ki lye ak NADH. Kantite NADH ki disponib ak potansyèl manbràn lan ansanm detèmine ki vitès koloran an redui ak kote li distribye, epi yon wout ki bezwen koloran redui bò kote sitokwòm c okside depann de chwa sa a.

Kijan pou li pwochen deklarasyon sou kontounman an

Mande ki konplèks ki te bloke, ak ki inibitè, nan ki sit ak nan ki dòz. Mande konsantrasyon koloran an ak ki lè yo te pran mezi a. Mande ki tisi, espès, metòd izolasyon, konsantrasyon pwoteyin ak sibstra yo te itilize. Epi mande si potansyèl, respirasyon, eta redoks ak yon tès transfè dirèk bay rezilta ki dakò, paske konsomasyon oksijèn poukont li te mennen nan move direksyon plis pase yon fwa isit la.

Rezime presi a rete valab. Gen akò sou kontounman Konplèks I ak koloran. Pou Konplèks III, mitokondri sourit ak antimisin a 1 microgram pa ml ak koloran a 1 micromolar pa montre okenn kontounman fonksyonèl, pandan twa espès ak antimisin a 0.3 micromolar oswa miksotyazòl a 1 micromolar ak koloran a 2 micromolar montre yon kontounman pasyèl ak transfè dirèk soti nan koloran an pou rive nan sitokwòm c. Deklarasyon sa yo ka vre an menm tan. Nenpòt konklizyon ki pi laj se yon ekstrapolasyon.

Lekti ki gen rapò yo kenbe deklarasyon ki konteste a nan kad chimi ki pa konteste a: kijan ble metilèn deplase elektwon pou relè a, eksperyans kontounman Konplèks I yo pou ka etabli nan pati ki pi bonè nan chèn lan, mezi potansyèl manbràn ak atifak yo pou konprann poukisa yo te bezwen de koloran, epi manipilasyon ajan ki fè sik redoks nan laboratwa pou pyèj ki gen rapò ak dòz ak moman mezi yo.