Altènativ a Ble Metilèn pou Mikwoskopi

Pou yon senp fwoti bakteri, vyolèt kristal ka ranplase ble metilèn lè objektif la se wè fòm selil yo. Pou selil vivan, yon pi bon altènativ ka se kontras faz san okenn koloran. Chwa a depann de obsèvasyon ou bezwen fè a.

Imajine de moun k ap egzamine menm kilti bakteri a. Youn vle fè diferans ant bakteri ki gen fòm baton ak selil won. Lòt la vle konnen si yon tretman te touye bakteri yo. Yon koloran ki bay premye moun nan yon imaj klè ka pa bay dezyèm moun nan okenn repons ki itil.

Anvan ou chwazi yon ranplasan, konplete fraz sa a: “Mwen bezwen obsève ___ nan ___, epi selil yo dwe / pa bezwen rete vivan.” Fraz sa a defini travay koloran an dwe fè.

Kòmanse ak echantiyon an ak kesyon an

Premye bagay la se deside si selil yo dwe rete vivan, epi apre sa idantifye karakteristik ou bezwen obsève a:

Selil yo dwe rete vivan: pou mouvman oswa fòm, konsidere kontras faz san koloran oswa DIC; pou ADN nikleyè, konsidere Hoechst 33342 ak fliyoresans; pou entegrite manbràn, chwazi yon analiz ki valide tankou SYTO 9 ak propidium iodide.
Selil yo pa bezwen rete vivan: pou mòfoloji bakteri, konsidere yon senp kolorasyon ak vyolèt kristal oswa yon kolorasyon negatif ak nigrozin; pou reyaksyon Gram, sèvi ak metòd konplè kolorasyon Gram lan; pou ADN nikleyè nan selil fikse, konsidere fliyoresans DAPI.

Sèvi ak tablo sa a pou konpare limit chak opsyon. Sa yo se chwa metòd, se pa enstriksyon pou ranplase yon boutèy ak yon lòt nan yon pwotokòl ki deja egziste.

Sa ou bezwen obsève	Echantiyon ak ekipman	Altènativ posib	Limit prensipal
Fòm ak aranjman bakteri	Fwoti bakteri prepare; limyè transmèt	Senp kolorasyon ak vyolèt kristal	Montre mòfoloji; li pa etabli reyaksyon Gram ni si selil yo vivan.
Kontou selil sou yon fon nwa	Preparasyon bakteryolojik; limyè transmèt	Kolorasyon negatif ak nigrozin	Preparasyon ak fòmilasyon an enpòtan; yon selil ki pa kolore pa nesesèman vivan.
Reyaksyon Gram	Fwoti bakteri prepare; limyè transmèt	Metòd konplè kolorasyon Gram	Mande tout sekans reyaktif yo ak kontwòl yo.
Mouvman oswa chanjman nan selil vivan	Preparasyon mouye konpatib; kontras faz oswa DIC	Pa gen koloran	Mande optik ki apwopriye; kontras la pa idantifye yon molekil.
ADN nikleyè	Selil fikse; fliyoresans	DAPI	Mande filtè eksitasyon ak emisyon ki konpatib.
ADN nikleyè nan selil vivan	Selil vivan; fliyoresans	Hoechst 33342	Antre nan selil la pa pwouve kondisyon imaj yo san danje.
Entegrite manbràn bakteri	Bakteri ki pa fikse; fliyoresans	SYTO 9 ak propidium iodide	Kolorasyon manbràn lan se yon mezi endirèk sou viabilite.

Pou yon senp fwoti, ranplase metòd la avèk prekosyon

Vyolèt kristal se yon opsyon pratik lè travay la se jwenn yon vizyalizasyon yon sèl koulè sou mòfoloji bakteri. Manyèl Analiz Bakteryolojik FDA a bay de fòmilasyon vyolèt kristal ki apwopriye pou senp kolorasyon. Sèvi ak yon fòmilasyon dokimante ansanm ak metòd preparasyon li; non koloran an pou kont li pa defini yon reyaktif ki pare pou itilize.

Vyolèt kristal parèt tou nan kolorasyon Gram, men sa pa vle di yon senp kolorasyon ak vyolèt kristal se yon kolorasyon Gram. Nan pwotokòl kolorasyon Gram ASM lan, rezilta diferansyèl la depann de vyolèt kristal, yòd, dekolorasyon, ak kontrekolorasyon k ap aji youn apre lòt. Si yo retire etap sa yo, sa chanje sa imaj la ka etabli. Gade senp kolorasyon kont kolorasyon Gram pou diferans sa a.

Nigrozin ofri yon lòt fason pou fè kontou yo parèt: li fè fon an vin nwa pandan selil bakteri yo rete relativman klè. Gen yon detay itil nan enstriksyon Merck pou nigrozin ke yon lis jeneral altènativ ka pa montre. Fòmilasyon travay yo espesifye a gen fòmaldeyid ladan. Se poutèt sa, ou pa ka dedwi li konpatib ak selil vivan sèlman paske yo rele l “kolorasyon negatif,” menm si selil yo menm sanble yo pa kolore. Verifye fòmilasyon konplè a ak preparasyon echantiyon an.

Pou echantiyon vivan, konsidere chanje optik la

Si ou vle gade selil yo deplase oswa divize, ajoute yon lòt koloran ka rann obsèvasyon an pi konplike. Jan Nikon eksplike sa nan gid li sou kontras nan echantiyon transparan, kontras faz ak kontras entèferans diferansyèl, oswa DIC, fè echantiyon yo vizib grasa diferans nan pwopriyete optik yo. Yo ka montre selil vivan ki pa kolore, depi mikwoskòp la gen konpozan ki nesesè yo.

Chwa sa a konsève yon preparasyon san koloran, men li chanje kalite enfòmasyon ki disponib. Ou ka swiv yon limit oswa yon mouvman san ou pa konnen ki molekil ki pwodui kontras la. Si kesyon an se lokalizasyon molekilè, chwazi yon metòd etikèt ki apwopriye pito.

Pou ADN nikleyè, konparezon Invitrogen ant DAPI ak koloran Hoechst fè diferans ant itilizasyon DAPI ki komen pou selil fikse ak Hoechst 33342, ki antre pi fasil nan selil epi ki prefere pou make selil vivan. Toude mande ekipman fliyoresans. Okenn ladan yo pa yon ranplasman dirèk pou yon koloran ki gen koulè nan mikwoskopi ak limyè transmèt.

Trete ekspozisyon ak koloran ak ekleraj kòm kondisyon eksperimantal. Konpare preparasyon ki kolore ak sa ki pa kolore lè konpòtman selil yo se mezi ou ap pran an.

Yon selil wouj pa otomatikman yon selil mouri

Yo souvan itilize SYTO 9 ak propidium iodide ansanm pou evalye entegrite manbràn bakteri. Manyèl BacLight la asosye manbràn entak ak kolorasyon vèt epi manbràn domaje ak kolorasyon wouj. Entèpretasyon sa a bezwen valide pou echantiyon an.

Yon etid Rosenberg ak kolaboratè li yo an 2019 montre pwoblèm nan. Nan biofilm E. coli ki te gen 24 èdtan sou vè nan solisyon saline ki gen tanpon fosfat, anviwon 96% nan selil yo te parèt pozitif pou propidium iodide an plas. Sepandan, otè yo te estime 82% te kapab kiltive apre yo te ranmase yo. Imaj konfokal yo te montre selil ki te gen pati enteryè vèt anba materyèl ki te kolore wouj, sa ki te montre asid nikleyik ekstraselilè te kontribye nan siyal ki te ka twonpe a.

Pousantaj sa yo dekri mezi diferan sou preparasyon etid la; yo pa yon faktè koreksyon inivèsèl. Leson itil la se verifye kisa ki te pwodwi siyal la. Nan yon biofilm, yon koloran pou asid nikleyik ka detekte materyèl deyò selil yo ansanm ak materyèl andedan selil ki domaje. Pou rive nan yon konklizyon sou viabilite, chèchè yo rekòmande mezi konplemantè, tankou kilti oswa aktivite metabolik, pandan yo rekonèt chak metòd gen limit pa li.

Verifye sa altènativ la genyen ladan li toutbon

Yon lòt metòd kolorasyon ka toujou gen ble metilèn ladan. Giemsa se yon egzanp: Merck dekri pwodwi li kòm yon solisyon azure-eosin-methylene-blue, ki fèt pou aplikasyon tankou fwoti san ak mwèl zo. Li ka yon metòd diferan pou yon echantiyon diferan, men li pa satisfè yon kondisyon ki mande pou pa gen ble metilèn.

Si eskli yon konpoze fè pati eksperyans lan, verifye idantite ak fòmilasyon reyaktif la anvan ou konpare imaj yo. Gid sou ble metil, ble metilèn, ak koloran ki gen non ki sanble eksplike diferans nan non yo.

Verifye ranplasman an anvan ou sèvi ak rezilta a

Pou yon nouvo metòd, fè yon ti konparezon ak echantiyon reprezantatif ak yon kontwòl apwopriye. Kenbe paramèt mikwoskòp la konparab kote sa posib. Anrejistre fòmilasyon reyaktif la, preparasyon echantiyon an, ekspozisyon an, ak kondisyon imaj yo pou yon imaj ki sanble pi bon ka egzamine olye pou yo senpleman prefere li.

Evalye siksè a selon kesyon orijinal la. Pou mòfoloji, evalye si limit ak aranjman selil yo toujou fasil pou entèprete. Pou etikèt nikleyè, evalye kote siyal la ye ak bri nan fon an. Pou viabilite, mande prèv ki depase yon bèl separasyon koulè. Gid ki pi laj sou kolorasyon ak ble metilèn ak aplikasyon laboratwa eksplike kijan obsèvasyon an ak preparasyon an mache ansanm.

Chwazi altènativ ki konsève mezi ou bezwen an. Koulè se sèlman youn nan pwopriyete imaj ki soti a.