Tumačenje izgleda kolonija E. coli i drugih bakterija na EMB agaru

Student iscrtkavanjem nanese nepoznati uzorak na agar s eozinom i metilenskim modrilom, inkubira ga preko noći i zatekne ploču s tamnim kolonijama zelenkastog sjaja. U bilježnici piše „E. coli, potvrđeno”. Takav zapis tvrdi više nego što ploča može potkrijepiti. Ploča pokazuje fenotip rasta i fermentacije u određenim uvjetima. Identitet vrste zasebna je tvrdnja koja zahtijeva zasebne dokaze.

Ovaj vodič pristupa rezultatima na EMB agaru kao zadatku tumačenja. Objašnjava osnovno načelo, vodi kroz ilustrativni atlas ploča s kontrolama i navodi slučajeve u kojima udžbenički prikaz može zavarati.

Načelo na kojem se temelji ploča

EMB agar istodobno je selektivan i diferencijalan. Bojila eozin Y i metilensko modrilo potiskuju mnoge gram-pozitivne organizme, pa podloga pogoduje rastu gram-negativnih organizama. Ista bojila djeluju kao indikatori: kada organizam fermentira dostupni šećer i lokalno proizvede dovoljno kiseline, kolonija snažno veže bojilo i poprima tamnoljubičastu do plavocrnu boju. Uz intenzivnu proizvodnju kiseline površina kolonije može pokazivati metalnozeleno prelijevanje boja. ASM-ov protokol za ploče s agarom s eozinom i metilenskim modrilom opisuje ovu kombinaciju selekcije i diferencijacije te pruža referentne fotografije za nastavu.

Prije tumačenja bilo kojeg rezultata važan je jedan detalj: provjerite koja se formulacija upotrebljava. Starija formulacija Holt Harris Teague sadrži laktozu i saharozu, dok Levine EMB sadrži samo laktozu. Organizam koji fermentira saharozu, ali ne i laktozu, poput mnogih izolata Serratia marcescens, može izgledati različito na tim dvjema inačicama. Dokumentacija proizvođača za EMB podloge izričito navodi tu razliku u formulaciji. Uz rezultat u bilježnicu zabilježite proizvođača i formulaciju.

Pripremljeni neinokulirani EMB agar obično je crvenosmeđ do crvenkastoljubičast, katkad sa zelenkastom nijansom ili finim talogom. Ta pozadinska boja nije rast. Svako očitanje usporedite s neinokuliranom pločom ili dokumentiranim početnim izgledom te očitajte primarnu ploču nakon otprilike 18 do 24 sata aerobne inkubacije pri 35 do 37 C, osim ako nastavni protokol ne određuje drukčije. Produljena inkubacija može promijeniti izgled povezan s fermentacijom.

Kako pregledati ploču

Upotrijebite dvije vrste osvjetljenja. Najprije pregledajte ploču pod reflektiranim ili kosim svjetlom i nagnite je: metalni sjaj nastaje prelijevanjem boja i može se pojaviti ili nestati ovisno o kutu gledanja. Zatim je pregledajte pod propuštenim svjetlom kako biste procijenili boju kolonija i tamna središta. Promatrajte dobro izolirane kolonije jer gust rast i susjedne kolonije mijenjaju lokalno nakupljanje kiseline te mogu oslabiti ili pojačati boju. ASM-ov skup slika to izravno pokazuje: E. coli u miješanoj kulturi može izgubiti očekivani sjaj jer okolni organizmi mijenjaju kiselost okoliša.

Uključite kontrole kad god vježba to dopušta. Uobičajeni nastavni skup obuhvaća E. coli ATCC 25922 za fenotip plavocrne boje i metalnog sjaja, nefermentirajući organizam poput Salmonella Typhimurium ATCC 14028 ili Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 za bezbojni fenotip te gram-pozitivni organizam poput Enterococcus faecalis ili Staphylococcus aureus kao kontrolu inhibicije, kako je navedeno u standardnim tablicama kontrole kvalitete za EMB podloge. Ako pozitivna kontrola nema sjaj, prije nego što posumnjate na nepoznati uzorak, razmotrite inkubaciju, gust rast ili formulaciju.

Ilustrativni atlas ploča

Ploče u nastavku generirane su ilustracije, a ne fotografije stvarnih kultura. Prikazuju obrazac koji treba tražiti, a ne točnu nijansu pojedinog soja. Usporedite ih s ASM-ovim referentnim fotografijama i stvarnim pločama iz nastavnog laboratorija.

Ploča 1: Escherichia coli na EMB agaru, intenzivna fermentacija laktoze

E. coli na EMB agaru obično je tamnoljubičasta do plavocrna, često s tamnim središtem i metalnozelenim sjajem koji nastaje zbog intenzivne proizvodnje kiseline. Sjaj je poznati nalaz koji studenti traže, ali smatrajte ga potpornim dokazom, a ne definicijom. Intenzitet sjaja ovisi o soju, trajanju inkubacije, gustoći kolonija i kutu gledanja. Odsutnost sjaja ne isključuje E. coli, a tamna kolonija bez sjaja može upućivati na nekoliko drugih fermentirajućih organizama. Za daljnji rad odaberite dobro izoliranu koloniju umjesto da očitavate iz područja gustog rasta.

Ploča 2: Klebsiella pneumoniae na EMB agaru, mukoidni fermentirajući organizam

Klebsiella pneumoniae na EMB agaru obično stvara velike, sjajne, mukoidne kolonije u ružičastoljubičastim do smeđeljubičastim nijansama, često s tamnim središtima, ali uglavnom bez izraženog metalnog sjaja. Slična se morfologija pojavljuje kod srodnih fermentirajućih organizama poput Enterobacter. Mukoidna tekstura i veličina kolonije dio su očitanja: mala i plosnata ružičasta kolonija ima drukčiju težinu pri tumačenju od velike, kupolaste mukoidne kolonije. Kao i kod E. coli, ploča upućuje na fermentacijski fenotip, a određivanje vrste zahtijeva biokemijsku potvrdu opisanu u nastavku.

Ploča 3: Salmonella na EMB agaru i drugi nefermentirajući organizmi, bezbojne kolonije

Salmonella na EMB agaru i srodni organizmi koji ne fermentiraju laktozu, uključujući Shigella i mnoge izolate Pseudomonas, obično rastu kao bezbojne do prozirne ili blijedo jantarne kolonije. Neke formulacije i uvjeti daju blagu ružičastu nijansu, pa blijedoružičasta kolonija ne znači automatski da je riječ o fermentirajućem organizmu. EMB ne razlikuje Salmonella od Shigella ni od drugih nefermentirajućih organizama; to se utvrđuje naknadnim testovima. Imajte na umu i da su dokumentirani sojevi Salmonella pozitivni na fermentaciju laktoze s metalno sjajnim kolonijama nalik kolonijama E. coli, što je još jedan razlog zbog kojeg jedna ploča ne može dati konačan odgovor.

Ploča 4: Serratia marcescens i zamka formulacije

Serratia marcescens zaslužuje zaseban odjeljak jer studenti često očekuju crvene kolonije pa pogrešno protumače ploču. Većina kliničkih izolata ne fermentira laktozu, pa na Levine EMB agaru obično izgledaju blijedo do slabo obojeno. Budući da mnogi izolati fermentiraju saharozu, formulacija koja sadrži saharozu može dati tamniju reakciju ili izraženiju reakciju povezanu s kiselinom. Ni pri 35 do 37 C nemojte očekivati karakteristični crveni pigment prodigiozin; proizvodnja pigmenta nepouzdana je na temperaturi inkubatora. Kada protokol spominje Serratia marcescens na EMB agaru, provjerite na koju se formulaciju tvrdnja odnosi. Pregled metabolizma bakterija roda Serratia sažima obrazac negativne fermentacije laktoze i promjenjive fermentacije saharoze koji stoji iza ove zamke.

Ploča 5: kontrole i inhibirani organizmi

Gram-pozitivni organizmi poput Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus i Bacillus uglavnom su inhibirani ili im je rast znatno potisnut na EMB agaru, premda inhibicija nije potpuna za svaki soj. Skup kontrola omogućuje pouzdano očitanje: kontrola E. coli trebala bi pokazivati dobar rast uz plavocrnu boju i sjaj, kontrola nefermentirajućeg organizma trebala bi pokazivati bezbojan rast, a kontrola inhibicije trebala bi pokazivati slab rast ili njegov izostanak. Ako kontrola inhibicije dobro raste, selektivni korak nije uspio i svako drugo očitanje na toj seriji podloge upitno je. Metode bojenja odgovaraju na drukčije pitanje od podloga za uzgoj; za laboratorijski rad s bojenjem preparata na predmetnim stakalcima pogledajte atlas bojenja metilenskim modrilom.

Usporedba uz ograničenja

Tri rečenice sažimaju zavaravajuće izglede. Tamna boja ne znači E. coli jer Klebsiella, Enterobacter i drugi fermentirajući organizmi razvijaju tamna središta bez sjaja. Ružičasta boja ne znači Klebsiella jer umjereno ili sporo fermentirajući organizmi te neki nominalno nefermentirajući organizmi izgledaju ružičasto ili blijedoljubičasto. Sjaj ne znači konačnu potvrdu E. coli jer ga mogu stvarati i drugi intenzivno fermentirajući organizmi. Nastavni protokol i njegovi prikazi miješanih kultura ilustriraju svaku od tih pogrešaka.

Ograničenja potvrde

EMB agar pokazuje fenotip, a ne vrstu. Različiti organizmi mogu imati jednak izgled kolonije, a jedan organizam može odstupati od svojeg udžbeničkog prikaza ovisno o soju, starosti, gustoći rasta, formulaciji i inkubaciji. Zato se u nastavnim i kliničkim postupcima morfologija na EMB agaru smatra preliminarnim pokazateljem.

Opravdan studentski postupak jest: opisati izoliranu koloniju (veličinu, boju, središte, sjaj pod kosim svjetlom, mukoidna obilježja), zabilježiti formulaciju, trajanje i temperaturu inkubacije te kontrole; zatim precijepiti dobro izoliranu koloniju radi dobivanja čiste kulture prije bilo kojeg potvrdnog testa. Uobičajena daljnja obrada uključuje bojenje po Gramu i reakcije IMViC za preliminarnu identifikaciju E. coli i koliformnih bakterija, TSI ili KIA te biokemijske panele specifične za organizam za crijevne organizme, uz serološku identifikaciju, MALDI TOF ili druge validirane metode identifikacije kada zadatak to zahtijeva. Za kontekst o mjestu EMB agara među selektivnim i diferencijalnim podlogama za crijevne organizme pogledajte uvode u podloge za uzgoj crijevnih organizama i daljnju obradu bojenjem po Gramu. Za povezano pitanje o tome što plavo bojenje preparata može, a što ne može dokazati, atlas bojenja metilenskim modrilom u istom duhu razdvaja opažanje od zaključka.

Zapišite opažanje prije zaključka. „Tamne plavocrne kolonije sa zelenim sjajem ovisnim o kutu gledanja na Levine EMB agaru nakon 24 sata, u skladu s intenzivnom fermentacijom laktoze” opravdan je zapis. „E. coli, potvrđeno” zahtijeva korak potvrde koji sama ploča ne može pružiti.