Tko je razvio ljubičasto bojenje krvi? Metilensko modrilo, Malachowski, Romanowsky i Giemsa

Eozin je crven. Metilensko modrilo je plavo. Pomiješajte ih, nanesite smjesu na osušeni krvni razmaz i dijelovi razmaza poprimit će ljubičastu boju.

Ne svi dijelovi. U dobro pripremljenom preparatu jezgre bijelih krvnih stanica poprimaju crvenoljubičastu boju, a unutar parazita malarije kromatin poprima istu boju, dok okolne crvene krvne stanice ostaju ružičaste, a citoplazma sivoplava. Upravo ljubičasta boja omogućuje razlikovanje tipova stanica.

Ni u jednoj bočici nema ljubičaste boje. Ona se pojavljuje tek kada određeni produkt razgradnje metilenskog modrila dođe u dodir s eozinom na predmetnom stakalcu, a 1880-ih i 1890-ih nitko nije znao da taj produkt postoji, a kamoli što je. Ljudi koji su tragali za tom bojom radili su s nečistim bojilima, samostalno, bez pouzdanog načina da utvrde što se nalazi u bočici nakon što je dva mjeseca stajala na polici.

Zato pitanje iz naslova ima više od jednog odgovora koji se može obraniti i zato se odgovor promijenio 2011.

Nalaz koji se mijenjao sa smjesom

Bojenje nije izumljeno. Razvijalo se postupno. Svaka promjena smjese donijela je točno jednu novu vidljivu informaciju, a slijed tih informacija najjasniji je način praćenja te povijesti.

Važan je obrazac u posljednjem stupcu. Svaki napredak proširio je raspon boja, a svako proširenje učinilo je vidljivom još jednu strukturu. Ljubičasta boja nije ukras te tehnike; ona čini razliku između opažanja prisutnosti parazita i opažanja njegove građe. Kako je samo bojilo iz BASF-ove tvornice bojila dospjelo u medicinu, duža je povijest s vlastitom dokumentacijom. Cijeli prethodni slijed, s izvorom za svaki unos, dostupan je kao kronologija doprinosa s poveznicama na izvore.

Slika: istih šest smjesa prikazano kroz ono što je bilo u posudi i ono što je iz nje proizašlo. Krugovi prikazuju bojila; blokovi ispod njih prikazuju boje koje su ta bojila mogla proizvesti u krvnom razmazu. Nigdje prije 1890. nema crvenoljubičastog bloka, a nigdje nakon nje on nije izostavljen.

Čovjek koji je namjerno upotrijebio boraks

Ernst Malachowski bio je liječnik u Breslauu, današnjem Wrocławu, koji je karijeru proveo u privatnoj praksi i u maloj klinici koju je vodio s kolegom, obavljajući laboratorijski rad u slobodno vrijeme. Rođen je u Strzelnu 12. ožujka 1857., studirao je medicinu na Sveučilištu u Breslauu i od 1882. do 1887. radio kao asistent interne medicine u Bolnici Svih svetih, tada drugoj najvećoj bolnici u Njemačkoj.

Počeo je 1888. dvostrukim bojenjem Chęcińskog i Plehna. U preparatu pripremljenom 1889. primijetio je da se kromatin jezgre plazmodija obojio drukčije od citoplazme, a zatim ustanovio da to ne može ponoviti. Pokušao je zakiseliti metilensko modrilo, što je pogoršalo rezultat. Pokušao ga je alkalizirati boraksom, što je djelovalo svaki put. Metodu je javno demonstrirao 15. lipnja 1890., a potpuniji opis objavio je u kolovozu 1891., uključujući uputu za primjenu boraksa. Zabilježio je da je bojenje trajalo dvadeset četiri sata i da su rezultati bili lako ponovljivi.

Dvadeset četiri sata dugo je razdoblje u dijagnostičkom laboratoriju, a njegov rad nije se podrobno bavio ljubičastocrvenom bojom jezgre parazita. Bez obzira na razlog, nitko se nije prihvatio namjerne alkalizacije metilenskog modrila sve dok to Nocht nije ponovno učinio 1898. Malachowski više nikada nije pisao o bojenju krvi.

Razlog zbog kojeg se do nedavno o njemu znalo tako malo leži u arhivima, a ne u nekoj tajni. U medicinskoj literaturi preživjelo je vrlo malo tragova njegova života, a ono što je preživjelo došlo je jednim putem. Njegova kći Marie otišla je iz Njemačke u London 1939., služila u britanskoj vojsci i nastanila se u Kanadi, a njezina zbirka obiteljskih dokumenata završila je u Institutu Leo Baeck u New Yorku. Njezin brat Leo poginuo je u Prvom svjetskom ratu. Njezina sestra Eva deportirana je iz Breslaua u tranzitni logor Izbica u travnju 1942. i nikada se nije vratila. Njezina majka Hedwig oduzela si je život 22. travnja 1942. umjesto da čeka istu deportaciju. Malachowski je umro 1934., prije svega toga.

Obiteljska povijest koja tako završava prestaje se citirati. Dva rada koja su Malachowskom vratila mjesto u razvoju tog bojenja, oba objavljena 2011., sastavljena su na temelju arhivskih dokumenata iz Poznańa i Wrocława te Marieinih dokumenata u New Yorku.

Pljesniva bočica i Rus kojem se posrećilo

Dmitri Romanowsky studirao je medicinu na Vojnomedicinskoj akademiji u Sankt Peterburgu i veći dio karijere bavio se malarijom. Godine 1890. objavio je metodu koja je na papiru bila gotovo istovjetna Chęcińskijevoj: nepromijenjeno metilensko modrilo i eozin, uz nešto više eozina.

U rujnu 1891. objavio je metodu koja ga je proslavila, a ključni detalj bio je skriven u uputama. Najbolje rezultate dobio je sa zalihom otopine metilenskog modrila, otopinom koja je stajala više od dva mjeseca i na kojoj je rasla plijesan. Plijesan i vrijeme stajanja djelomično su demetilirali bojilo. Romanowsky to nije znao niti je mogao time upravljati, a drugi istraživači koji su pokušali primijeniti njegovu metodu nisu mogli dobiti ljubičastu boju. Njegova je disertacija predana u Sankt Peterburgu u lipnju 1891., zbog čega se u uobičajenim prikazima 1891. smatra godinom otkrića.

Malachowski je svoju demonstraciju održao u lipnju 1890., više od godinu dana ranije, a njegova je metoda djelovala zahvaljujući namjernom postupku.

Zašto je bojenje nazvano po pogrešnom čovjeku

Argumente u prilog Malachowskom prikupili su Kristine Krafts, Ernst Hempelmann i Barbara Oleksyn, a oni se temelje na četiri stvari. Datumu javne demonstracije, lipnju 1890. nasuprot rujnu 1891. Riječi namjerno nasuprot riječi slučajno. Činjenici da je Malachowski objavio svoju metodu, uključujući boraks, dok je Romanowskyjeva ovisila o nekontroliranoj varijabli. I zapažanju da je opis jezgre plazmodija, zajedno s ljubičastom bojom koja ju je otkrila, praktički nestao iz literature na sedam godina jer nitko nije mogao ponoviti slučajnu inačicu.

Njihov je zaključak izravan. U biografskom radu tu atribuciju nazivaju „izrugivanjem” i citiraju Ralpha Lillieja, koji je 1978. napisao da bismo „možda ovu skupinu bojenja trebali nazivati bojenjima po Malachowskom”.

Ta je tvrdnja osporavana, kao što tvrdnje o prvenstvu obično jesu, a prirodu tog spora vrijedi objasniti umjesto presuditi o njoj. Rasprava o prvenstvu mora odrediti što je bilo otkriće. Ako je otkriće ljubičasta boja, Malachowski ima raniju dokumentiranu demonstraciju. Ako je otkriće objavljena metoda, obojica su je objavila 1891., a bojenje je nazvano po Romanowskom. Ako je otkriće objašnjenje, nijedan nema pravo na prvenstvo jer nijedan nije znao da je dozrijevanje zapravo demetilacija i nijedan nije mogao objasniti zašto se boja uopće pojavljuje. Upravo tu posljednju točku popularni prikazi preskaču. Aktivni sastojak bio je nečistoća koju nitko nije identificirao, a prva osoba koja je namjerno proizvela boju učinila je to prema ponovljivoj empirijskoj recepturi, a ne na temelju razumijevanja onoga što ta receptura radi.

Dva rada iz 2011. najpotpuniji su objavljeni prikaz argumenata u prilog Malachowskom, a oba su besplatno dostupna za čitanje putem PubMeda: opsežni pregledni rad pod PMID 21235291 i biografski rad pod PMID 21660627. Zapis preglednog rada u PubMedu navodi i komentar na njega, objavljen u istom časopisu kasnije te godine na 86(5):366, što je opravdan podsjetnik da je argument bio osporavan u tisku čim se pojavio.

Taj spor nije neslaganje o kemiji. Svi uključeni slažu se oko toga što je ljubičasta boja i koji je sastojci proizvode. Neslaganje se odnosi na to tko je prvi došao do nje i na to može li se slučajnost koju nitko nije mogao ponoviti uopće smatrati takvim postignućem.

Što su donijela kasnija imena

Ako je Malachowski prvi proizveo ljubičastu boju, zašto bojenje nosi imena Romanowskog, Wrighta i Giemse?

Zato što bojenje koje jednom uspije u rukama svojeg izumitelja još nije reagens. Kasniji je rad pretvorio hirovitu smjesu u nešto čime se tehničar u drugoj zemlji mogao poslužiti bilo kojeg utorka.

Nocht je do toga došao zaključivanjem. Nakon što jednostavnim neutralnim bojilom nije uspio dobiti pouzdan rezultat, zaključio je da ljubičasta boja mora potjecati od nečega u metilenskom modrilu što nije metilensko modrilo i krenuo to tražiti. Unna je već bio primijetio da odležane otopine metilenskog modrila boje granule mastocita crveno te je pretpostavio da tijekom dozrijevanja bojila nastaje nova tvar. Bernthsen je 1885. pokazao da se u alkalnim uvjetima s metilenskog modrila uklanjaju metilne skupine i da su ti produkti ono što danas nazivamo azurima. Nocht je aktivnu frakciju ekstrahirao kloroformom i mogao ju je nazvati samo crvenim iz metilenskog modrila; Michaelis ju je 1901. nazvao azurom I. Jenner je riješio logistiku. Ponovnim otapanjem taloga metilenskog modrila i eozina u apsolutnom metanolu dobivena je jedna stabilna otopina koja je fiksirala razmaz tijekom bojenja i uklonila potrebu za fiksacijom toplinom. Leishman i Reuter kombinirali su polikromirano bojilo s alkoholnim otapalom te istodobno dobili stabilnost i ljubičastu boju. Wright je dvanaestosatnu inkubaciju na 65 °C i deset dana stajanja zamijenio jednim satom u struji pare. Giemsa se potpuno prestao oslanjati na nasumično dozrelu otopinu te je upotrijebio odmjerene količine poznatih bojila s glicerolom u metanolu kako bi proizvod izdržao tropsku vrućinu. Nikada nije objavio kako je proizvodio čisti metilenski azur. Prodavao ga je laboratoriju dr. Grüblera u Leipzigu, koji ga je stavljao na tržište kao azur I i tvrdio da je samo njegova inačica autentično Giemsino bojilo.

O identitetu tog azura još se raspravlja. Neki smatraju da je to bilo jednostavno polikromirano metilensko modrilo, a drugi da je bilo bogato bojilom Azure B. Odgovor je proizašao iz rata. Kada su njemačka bojila postala nedostupna, tim Službe za javno zdravstvo Sjedinjenih Američkih Država, Ralph Lillie s Mauriceom Roeom i Aimee Wilcox, ustanovio je da najbolje bojenje daju tri odvojena sastojka: nepromijenjeno metilensko modrilo, njegov demetilirani produkt razgradnje Azure B i eozin. Azure B zamijenio je nedostupni azur I, a ta su tri sastojka i danas osnova bojila koje se upotrebljava za dijagnosticiranje malarije.

Kemija međudjelovanja tih triju sastojaka na predmetnom stakalcu zasebno je pitanje i tema druge stranice. Stranica o ulogama bojila i kemiji bojenja tipa Romanowsky objašnjava što rade Azure B i eozin te zašto njihov par proizvodi boju koju nijedan ne proizvodi samostalno. Stranica o mikroskopiji i laboratorijskim primjenama obrađuje praktičnu stranu: što određeni preparat pokazuje i kako procijeniti je li određeni proizvod prikladan za metodu koju namjeravate upotrijebiti.

Dio povijesti koji je i dalje aktualan

Jedan detalj iz ove priče nije prestao vrijediti 1902. Otprilike pedeset godina najvažniji sastojak standardnog svjetskog bojila za malariju bio je neimenovana nečistoća. Bila je prisutna slučajno, njezina se količina razlikovala od bočice do bočice, njezin je identitet dio tog vremena bio poslovna tajna, a o njezinu se udjelu raspravljalo sve do 1940-ih. Ljudi koji su upotrebljavali to bojilo nisu bili nemarni. Nisu imali načina saznati što je u bočici.

Suvremena inačica istog problema jest specifikacija koja opisuje samo dio materijala. Sukladnost s USP-om put je do najviše čistoće koju tržište nudi, jer je riječ o cjelovitom objavljenom standardu, a ne o jednom mjerenju: identitet, čistoća, organske nečistoće uključujući azurna bojila, ostatna otapala, elementarne nečistoće, ostatak nakon žarenja, mikrobiološke granice i bakterijski endotoksini. Blupreme nabavlja metilensko modrilo od farmaceutskog proizvođača i objavljuje potpuni certifikat analize kako bi se svaka stavka tog popisa mogla provjeriti, a ne samo ustvrditi. Certifikat koji navodi rezultat za teške metale i naziva ga sukladnošću s USP-om današnji je ekvivalent bočice s oznakom „dozrelo metilensko modrilo”: možda je riječ o dobrom reagensu, ali oznaka ne govori što se u njemu nalazi.