Testovi kvasca metilenskim modrilom: brojanje živih stanica nasuprot mjerenju vremena respiracije

Na laboratorijskom stolu stoje dvije epruvete. Obje su plave. U jednoj plave stanice pod mikroskopom znače mrtav kvasac. U drugoj epruveta koja iz plave postaje bezbojna znači da je kvasac živ i respirira. Isto bojilo, suprotna tumačenja. Pomiješate li ta dva testa, svaki se zaključak preokreće.

Ta je razlika okosnica cijelog članka. Metilensko modrilo je redoks-bojilo: u oksidiranom je obliku plavo, a u reduciranom je obliku bezbojno leukometilensko modrilo. Brojanje vijabilnih stanica iskorištava tu kemiju za kratku mikroskopsku snimku stanja. Pokus respiracije iskorištava je u vremenski praćenoj reakciji cijele smjese. Svaki zahtijeva vlastiti protokol, vlastite kontrole i vlastitu dozu skepticizma.

Brojanje vijabilnih stanica: kratko bojenje i pravodobno očitavanje

Pivarski protokol najstandardiziranija je inačica. Pripremite 0.01% w/v metilenskog modrila u 2% natrijevu citratu, pomiješajte ga u omjeru 1:1 sa suspenzijom kvasca i pregledajte smjesu nakon kratkog, unaprijed određenog intervala. Objavljeni intervali kreću se od 1 do 2 minute u priručniku instituta Brewing Science Institute do približno 5 minuta u istraživačkim protokolima, dok OIV-ova metoda mikrobiologije vina zahtijeva pregled unutar 10 minuta. Konačna koncentracija bojila u smjesi za brojanje iznosi približno 0.005%. Napunite poboljšanu Neubauerovu komoru i pri povećanju od približno 400x razvrstajte tamnoplave stanice kao nevijabilne, a neobojene kao vijabilne. Prema OIV-ovoj metodi svijetloplave stanice smatraju se živima, što već upućuje na problem subjektivnosti o kojem se govori u nastavku.

Koncentracija stanica izračunava se iz geometrije komore. Kada se prebroji cijeli središnji kvadrat stranice 1 mm, broj stanica po mL jednak je N puta faktor razrjeđenja puta 10^4, pri čemu je N broj stanica na toj površini, kako je navedeno u ASBC-ovim metodama za kvasac. Vijabilnost se računa jednostavnije: broj neobojenih stanica podijeljen ukupnim brojem stanica, puta 100. Za procjenu vijabilnosti prebrojite približno 400 stanica, prema FEMS-ovoj usporednoj studiji u pivovarstvu i OIV-ovoj praksi. Dosljedno primjenjujte jedno pravilo za rubne stanice, primjerice uključite stanice na donjoj i lijevoj crti mreže, a isključite one na gornjoj i desnoj.

Pravilo za pupove treba odrediti prije početka brojanja. Prema uobičajenoj konvenciji pup se broji kao zasebna stanica kada dosegne približno polovicu veličine matične stanice, a dok je manji, broji se zajedno s njom. Koje god pravilo odabrali, primijenite ga na svaki kvadrat i zapišite ga na radni list kako bi ga sljedeća osoba mogla ponoviti.

Radni list za brojanje (ispišite ga)

Ovaj je radni list izvorni materijal izrađen za ovaj članak. Prepišite ga u bilježnicu ili ispišite po jedan za svaki uzorak.

Vijabilnost (%) = 100 x neobojene / (neobojene + tamnoplave). Ukupan broj stanica po mL = N x faktor razrjeđenja x 10^4, pri čemu N potječe iz definirane površine komore. Uz rezultat zabilježite interval bojenja jer vrijednost vijabilnosti bez podatka o vremenu očitavanja nije reproducibilna.

Zašto vrijednosti vijabilnosti variraju

Vrijeme je prva smetnja, a djeluje u oba smjera. Metabolički aktivne stanice reduciraju bojilo, pa prerano očitavanje može zateći žive stanice prije nego što dovrše redukciju i pogrešno ih svrstati među mrtve. Međutim, produljena izloženost sama je po sebi toksična i stvara doista oštećene plave stanice, što dovodi do lažno pozitivnog bojenja mrtvih stanica. Zato laboratorijski nastavni protokol propisuje ocjenjivanje unutar 5 minuta, kako je dokumentirano u nastavnom protokolu za kvasac iz Wisconsina. Pouzdano se može reći da ocjenjivanje metilenskim modrilom ovisi o vremenu, pa odaberite jedan kratak interval i održavajte ga jednakim za svaki uzorak u seriji.

Uzorci niske vijabilnosti nose drugi izvor pristranosti. Standardizirana metoda upozorava da metilensko modrilo može precijeniti stvarnu vijabilnost kada je ona ispod približno 80%, jer stanice koje još reduciraju bojilo ne moraju zadržati sposobnost razmnožavanja. Pivarska literatura opisuje istu nepouzdanost kada je vijabilnost znatno smanjena. Metilensko modrilo smatrajte brzom, približnom procjenom, a važne odluke pri niskoj vijabilnosti, poput ponovnog nacjepljivanja kulture, potvrdite brojanjem kolonija na pločama ili komplementarnim bojenjem.

Učinci matriksa treći su čimbenik. OIV-ova metoda provodi se pri pH oko 4.6 i upozorava da snažno puferirani uzorci niskog pH onemogućuju pravilno ponašanje bojila. Također se ne preporučuje primjena testa pri koncentraciji šećera većoj od 100 g/L, kada stanice poprimaju zavaravajuću svijetloplavu boju. Eksperimentalna usporedba pH pri bojenju pokazala je znatne promjene osjetljivosti u ispitivanom rasponu, u skladu sa studijom metode s metilenskim modrilom ovisne o pH. Ostaci su zasebna zamka: obojene čestice u nečistim kominama nalikuju mrtvim stanicama i povećavaju varijabilnost među analitičarima.

Ta je varijabilnost izmjerena, a ne tek anegdotalno opisana. U šestomjesečnom pivarskom ispitivanju opisanom u FEMS-ovoj usporedbi metoda za kvasac, ponovljena mjerenja metilenskim modrilom imala su prosječnu standardnu devijaciju od 6.1%, u usporedbi s 0.2% za protočnu citometriju s oksonolom, dok su se rezultati dvaju analitičara za isti uzorak razlikovali do 13 postotnih bodova. Kvantitativna usporedba metoda vijabilnosti iz 2023. pokazala je znatno veću preciznost fluorescentne mikroskopije i protočne citometrije, ali i da uspješnost metode ovisi o vrsti i matriksu. Klasični opis metode autora Painting i Kirsop (PMID 24430080) ostaje referentna točka, a širi pregled testova vijabilnosti i vitalnosti kvasca (PMID 25154541) svrstava metilensko modrilo među komplementarne, a ne konačne testove. Tripansko modrilo ovdje nije automatski bolji izbor: ono pokazuje gubitak integriteta membrane, dok metilensko modrilo pokazuje unos bojila i redukcijsku aktivnost, pa se stanice pod stresom mogu različito razvrstati ovisno o korištenom bojilu.

Pokus respiracije: mjerite vrijeme nestajanja plave boje

U drugom se testu uopće ne koristi mikroskop. Kvasac, glukoza i razrijeđeno metilensko modrilo stavljaju se u zatvorenu epruvetu, a mjeri se koliko je vremena potrebno da plava boja nestane. Tijekom metabolizma stanice stvaraju redukcijske ekvivalente koji pretvaraju plavo bojilo u njegov bezbojni oblik, dok ga otopljeni kisik ponovno oksidira. Kada stanice smanje količinu kisika, prevladava neto redukcija i epruveta se obezboji. Završna točka stoga odražava ravnotežu respiracije, koncentracije bojila i dostupnosti kisika te je treba navoditi kao vrijeme redukcije ili obezbojenja metilenskog modrila, a ne kao izravnu brzinu potrošnje molekularnog kisika.

Koristite znatno razrijeđenije bojilo nego pri ispitivanju vijabilnosti kako bi vrijeme mjerenja bilo u praktičnom rasponu. AQA-ov priručnik obveznih praktičnih vježbi za razinu A to dobro standardizira: 1 g glukoze na 100 mL vode zagrijane na približno 30 C, 5 g suhog kvasca dodanog neposredno prije uporabe te radna otopina bojila koncentracije približno 0.001%, pripremljena razrjeđivanjem 0.1 mL matične otopine od 1% do volumena od 100 mL. Pomiješajte 2 mL suspenzije kvasca i glukoze s 2 mL radne otopine bojila, pustite da smjesa postigne ispitnu temperaturu, protresite je jednom tijekom 10 sekundi, pokrenite štopericu i više je ne tresite. Protresanje ponovno unosi kisik i vraća plavu boju u epruvetu, što je najveći pojedinačni proceduralni artefakt. AQA navodi da bi se pripravak pri 35 C u pravilu trebao obezbojiti unutar približno 5 minuta, uz prosječna vremena pokusa od 275 s pri 20 C, 128 s pri 35 C i 145 s pri 45 C. To su primjeri iz jednog postava, a ne univerzalne referentne vrijednosti. Kvantitativnu vezu između brzine redukcije i metabolički aktivnog kvasca u kontroliranim uvjetima podupiru namjenske studije redukcije, uključujući rad indeksiran kao PMID 25773544 i mehanističku studiju u časopisu Yeast (2014).

Prikaz vremenskog tijeka (izvorni materijal)

Tablica u nastavku izvorni je prikaz izrađen za ovaj članak prema prethodno opisanom AQA-ovu postavu: 2 mL smjese kvasca i glukoze uz 2 mL radne otopine bojila koncentracije približno 0.001%, jedno protresanje tijekom 10 sekundi, a zatim inkubacija bez pomicanja. Unosi su primjeri očitanja u obliku u kojem bi ih studentska skupina trebala bilježiti, uz indeks brzine definiran kao 1 podijeljen vremenom obezbojenja u sekundama. Provedite pokus s istim epruvetama i zamijenite ove unose izmjerenim vrijednostima.

Prikažite indeks brzine u ovisnosti o temperaturi za epruvete A, B i C. Krivulja raste, a zatim se izravnava ili pada, što je očekivani obrazac procesa pokretanog enzimima, a ne ravna crta. Epruvete D, E i F nisu podatkovne točke na toj krivulji. One su kontrole koje omogućuju njezino tumačenje.

Kontrole koje svakom testu daju smisao

Svaka serija respiracijskih pokusa treba tri popratne kontrole. Prokuhani ili usmrćeni kvasac s glukozom i bojilom trebao bi ostati plav, čime se potvrđuje da brza redukcija ovisi o metabolizmu živih stanica. Živi kvasac s bojilom bez dodane glukoze služi kao kontrola supstrata, no i tada očekujte sporo obezbojenje jer kvasac troši endogene zalihe. Glukoza s bojilom bez kvasca kemijska je slijepa proba, nužna zato što glukoza u alkalnim uvjetima može reducirati metilensko modrilo i bez prisutnih stanica.

Brojanje vijabilnih stanica zahtijeva drukčiju vrstu kontrole: dosljednost postupka. Ista matična otopina bojila, isti omjer miješanja, isti interval bojenja, ista površina komore, ista pravila za pupove i rubne stanice te, gdje je moguće, brojanje bez uvida u identitet uzorka. Kada se rezultati dvaju analitičara razlikuju za deset bodova, radni list obično otkriva uzrok: različito vrijeme očitavanja, različit prag za plavu boju ili različita pravila za pupove. Tehnike pripreme i promatranja obojenih stanica povezane su s metodama jednostavnog bojenja bakterija, dok se širi pregled struktura koje bojilo označava u različitim uzorcima nalazi u atlasu mikroskopskog bojenja. Za fizikalnu osnovu kvantitativnog očitavanja bilo kojeg intenziteta plave boje, referentni podaci o apsorpciji s navedenim uvjetima objašnjavaju zašto svaki koeficijent mora biti popraćen podacima o otapalu, pH i koncentraciji.

Odaberite test prema pitanju. Koliko je stanica trenutačno živo pitanje je brojanja, na koje se odgovara mikroskopom i radnim listom. Koliko aktivno ova kultura respirira kinetičko je pitanje, na koje se odgovara štopericom i kontroliranim epruvetama. Metilensko modrilo služi za oboje, ali nikada u istoj epruveti u isto vrijeme.