Metilensko modrilo u istraživanjima zebrica: uzgojni dodatak i ometajući čimbenik u pokusima

Voda za jajašca zebrica često je blago plava, a gotovo nitko ne bilježi zašto. Bojilo je metilensko modrilo, dodano protiv gljivica, a većina ga protokola tretira kao pozadinski uvjet. To je ovdje pogrešan koncept. Bolje ga je smatrati nenavedenim eksperimentalnim čimbenikom: nečim što je prisutno u tretiranim posudama, a odsutno u kontrolama, farmakološki aktivno pri primijenjenim koncentracijama i sposobno mijenjati upravo one ishode koje pokus mjeri.

Ta je razlika temelj svega što slijedi. Rutinska primjena protiv gljivica u uzgoju jedno je pitanje. Je li dodatak neutralan u odnosu na vaš test, drugo je pitanje. Novija literatura o zebricama na prvo odgovara umirujuće, a na drugo zabrinjavajuće.

Što smjernice zapravo propisuju

Ne postoji jedinstven standard, što je dio problema. Smjernice Kanadskog vijeća za skrb o životinjama dopuštaju 0.5 mg/L, odnosno 0.00005%, u otopini za transport jajašaca i ličinki radi smanjenja rasta gljivica. Europske smjernice za laboratorijske životinje opisuju držanje embrija u mediju koji često sadrži istih 0.00005%. Recept za E3 medij ustanove Cold Spring Harbor kao sastojak navodi dvostruko veću koncentraciju, 1 mg/L odnosno 0.0001%. Nasuprot tome stoji upadljiv izostanak: OECD-ova smjernica za ispitivanje toksičnosti na ribljim embrijima propisuje rekonstituiranu vodu za razrjeđivanje i ispitivanu kemikaliju, bez preporuke za metilensko modrilo, kako u verziji iz 2013 tako i u kasnijoj reviziji. Tako jedan laboratorij uzgaja embrije zebrica s metilenskim modrilom u plavoj vodi od prvih sati života, drugi provodi regulatorno ispitivanje na embrijima u bistroj vodi, a oba svoj medij nazivaju uobičajenim. Svatko tko uspoređuje rezultate različitih laboratorija ili objedinjuje povijesne kontrolne podatke nasljeđuje tu nedosljednost.

Radi boljeg razumijevanja koncentracija, 0.00005% iznosi približno 1.56 mikromolarnih, a 0.0001% približno 3.13 mikromolarnih. To su male vrijednosti i lako ih je protumačiti kao preniske da bi bile važne. Istraživanja u nastavku provjeravaju upravo tu pretpostavku, pri upravo tim koncentracijama.

Čitatelji koji dolaze iz akvaristike, a ne iz laboratorija, susreću istu molekulu u drukčijem okruženju, opisanom u akvarističkom vodiču za metilensko modrilo. Kemija je ista; objašnjenje načina na koji bojilo prenosi elektrone kroz stanice pokazuje zašto se redoks-aktivan spoj stalno pojavljuje u radovima o metabolizmu. Ono što slijedi odnosi se posebno na vodu za jajašca zebrica s metilenskim modrilom.

Metabolizam: učinak mijenja predznak ovisno o stadiju

Najinformativnije istraživanje izlagalo je zebrice koje se normalno razvijaju od prvog dana života do 5 dana nakon oplodnje te mjerilo oksidativni metabolizam u svakom stadiju, kako opisuje objavljeni izvještaj o pokusima metabolizma embrija. Taj obrazac treba pažljivo opisati jer se smjer učinka preokreće.

Pri 1 danu nakon oplodnje bazalna potrošnja kisika porasla je u izloženih embrija pri objema uzgojnim koncentracijama. Pri 2 dana potencijal mitohondrijske membrane u površinskom sloju ličinki bio je povišen pri izlaganju koncentracijama od 0.00005%, 0.0001% i 0.0003%. Do 4 do 5 dana, nakon izlijeganja, predznak se preokrenuo: oksidativna potrošnja energije smanjila se, bilo da je izlaganje bilo neprekidno od oplodnje ili akutno, samo od 3. do 4. dana. Istodobno se smanjila količina transkripata za podjedinice mitohondrijskih respiracijskih kompleksa i pri 1 i pri 4 dana, zajedno s transkriptima povezanima sa steroidogenezom i glukoneogenezom.

Još dva opažanja dodatno pojašnjavaju sliku. Izlijeganje je pri višoj uzgojnoj koncentraciji započelo nešto ranije: izloženi embriji prednjačili su pri 2 dana, a kontrolni su ih sustigli do 3. dana. Sama stresna os pritom je djelovala očuvano: kada su ličinke stare 5 dana bile podvrgnute stresoru u obliku vrtloženja vode, kortizol u cijelom tijelu normalno je porastao u objema skupinama. Dakle, pri tim dozama bojilo nije opći razvojni otrov i ne prigušuje svaki fiziološki odgovor. Ono mijenja energetski metabolizam ovisno o stadiju: povećava ga prije izlijeganja, a smanjuje nakon njega.

Ponašanje: zašto se dva istraživanja ne slažu i zašto oba mogu biti točna

Literatura o ponašanju djeluje proturječno dok se dizajni izlaganja ne usporede jedan uz drugi. Jedno istraživanje razvojne i bihevioralne sigurnosti izlagalo je embrije od približno 6 sati nakon oplodnje koncentracijama do 10 mikromolarnih, svakodnevno obnavljalo otopine do 4. dana, zatim premjestilo ličinke u medij bez bojila tijekom 5. i 6. dana te 6. dana ispitalo lokomociju testom svjetlo–tama. Rezultat: nije bilo značajnog učinka na smrtnost, izlijeganje ili morfologiju, niti učinka tretmana na lokomociju. Autori su opravdano preporučili 10 mikromolarnih kao gornju granicu u svojim uvjetima.

Druga skupina, čiji su se autori djelomično preklapali s autorima istraživanja metabolizma, provela je izlaganje onako kako uzgoj stvarno izgleda: bojilo je bilo prisutno od 2 do 3 sata nakon oplodnje uz svakodnevno djelomično obnavljanje, a ponašanje se mjerilo tijekom izlaganja ili nedugo nakon njega. Pri istim rutinskim koncentracijama ličinke su pokazale smanjenu lokomociju u 24-satnom testu, što se moglo ponoviti u različitim sojevima i laboratorijima, a istraživanje ometanja bihevioralnih mjerenja povezalo je učinak sa serotonergičkim tonusom, u skladu s poznatom inhibicijom monoaminooksidaze koju uzrokuje bojilo. Najrječitiji je nalaz bio da je medij za embrije s metilenskim modrilom prikrio očekivani lokomotorni odgovor na SSRI fluoksetin. Probirni test proveden u plavoj vodi stoga može propustiti učinak lijeka koji bi bistra voda otkrila.

Stvarne proturječnosti nema. Spoj u jednom testu može ne ostaviti nikakav mjerljiv preostali učinak dva dana nakon uklanjanja, a u drugom i dalje biti aktivan dok je prisutan. Praktično tumačenje jest da rezultat bez utvrđenog učinka opravdava gornju granicu koncentracije, a ne tvrdnju o neutralnosti, dok rezultat s utvrđenim učinkom opisuje važan rizik: aktivno izlaganje tijekom razdoblja mjerenja, u točno onim uvjetima koje koristi većina laboratorija.

Redoks-bojilo unutar redoks-testa

Još jedna zamka zaslužuje zaseban odlomak jer narušava mjerenje, a ne samu životinju. Test potrošnje energije Alamar Blue i sam se temelji na redoks-kemiji: redukciji resazurina u fluorescentni rezorufin. Metilensko modrilo također sudjeluje u redoks-kemiji. U kontrolama bez stanica obje su uzgojne koncentracije nakon 24 sata blago, ali značajno smanjile fluorescenciju Alamar Blue. U pokusima na životinjama izloženi su embriji prije testa isprani najmanje tri puta u mediju bez bojila, a biološki učinak u izlegnutih ličinki bio je veći od interferencije bez stanica. Stoga vrijedi oboje: isprane životinje pokazuju stvaran metabolički učinak, a neisprano bojilo povrh njega dodaje izravan kemijski artefakt. Kontrole moraju razdvojiti ta dva učinka, inače nijedna vrijednost nema smisla. Opće smjernice za tumačenje rezultata testova temeljenih na bojilima ovdje su posebno važne.

Vremenski pregled razvojnih stadija

Izvorni prilog ovom članku. Ako nije drukčije navedeno, koncentracije su dvije standardne uzgojne vrijednosti, 0.00005% i 0.0001%.

Obrazac koji treba zapamtiti jest rani porast i kasniji pad metaboličkih ishoda, uz bihevioralne učinke prisutne tijekom izlaganja, ali nemjerljive nakon uklanjanja bojila u jedinom testu koji je to ispitao.

Kontrolni popis za dizajn kontrola

Drugi izvorni prilog. Koristite ga kada se protokoli za zebrice s metilenskim modrilom primjenjuju u pokusu.

1. Navedite bojilo kao reagens, a ne kao vodu. Navedite koncentraciju u postocima i mikromolarnim vrijednostima, početak i završetak izlaganja u satima ili danima nakon oplodnje, raspored obnavljanja te razdoblje bez bojila prije svakog mjerenja.
2. Prilagodite kontrole pitanju. Istraživanje ispitivane kemikalije treba kontrole bez bojila; istraživanje uzgojnih postupaka treba skupine bez bojila i s bojilom uz bilježenje ishoda djelovanja protiv gljivica, jer nijedno od citiranih istraživanja nije mjerilo djelotvornost protiv gljivica.
3. Isperite prije redoks-testova, a zatim provjerite. Isperite najmanje tri puta u mediju bez bojila i usporedno provedite kontrolu bez stanica koja sadrži bojilo i reagens, jer bojilo izravno smanjuje signal Alamar Blue.
4. Ponašanje i ishode povezane s monoaminima smatrajte visokorizičnima. Istraživanja lokomocije, refleksa trzaja, ponašanja nalik anksioznosti, antidepresiva i inhibitora MAO trebaju izbjegavati bojilo tijekom mjerenja ili dokazati neutralnost za konkretan ishod; razdoblje od jednog do dva dana bez bojila uklonilo je jedan lokomotorni učinak, ali to nije dokazano za druge eksperimentalne paradigme.
5. Metaboličke i mitohondrijske ishode smatrajte visokorizičnima u svakom stadiju. Potrošnja kisika, potrošnja energije, membranski potencijal i transkripti respiracijskog lanca mijenjaju se pri uzgojnim koncentracijama, i to u suprotnim smjerovima prije i nakon izlijeganja.
6. Ne prenosite zaključke o neutralnosti s jednog dizajna na drugi. Rezultat bez utvrđenog učinka nakon uklanjanja bojila ne vrijedi za izlaganje koje traje; izostanak morfološkog učinka ne znači izostanak učinka na metabolizam ili interakciju s lijekom; rezultat za jedan soj, temperaturu ili trajanje testa ne vrijedi za druge.
7. Navedite smjernicu koju ste slijedili i njezinu alternativu. Izričito navedite koncentracije prema smjernicama CCAC-a, europskim smjernicama ili receptu ustanove Cold Spring Harbor te napomenite da OECD-ov test na embrijima ne uključuje bojilo, kako bi čitatelj mogao razumjeti uvjete u kojima su vaše životinje držane.

Ništa od ovoga nije argument protiv upotrebe bojila za održavanje jajašaca na životu. To je argument protiv toga da se uzgojna odluka nepreispitano prenese u podatke. Plava boja u posudi potječe od molekule s farmakološkim djelovanjem, a pokusi koji će najvjerojatnije biti iskrivljeni upravo su metabolički i neurobihevioralni probiri visoke propusnosti, za koje se danas prednost daje mladim zebricama. Zabilježite bojilo, uključite odgovarajuće kontrole, uklonite ga prije mjerenja i provjerite test u kojem bi moglo neprimjetno sudjelovati.