Metilensko modrilo i ALS: zašto se rezultati razlikuju među eksperimentalnim modelima

Pretražite metilensko modrilo i ALS pa ćete pronaći dvije tvrdnje koje naizgled proturječe jedna drugoj. Prema jednoj, plavo bojilo zaštitilo je neurone u modelima ALS-a. Prema drugoj, nije imalo učinka u mišjem modelu ALS-a. Obje tvrdnje upućuju na stvarne znanstvene radove i oba rada zaslužuju ozbiljno razmatranje. Proturječje nestaje kada jasno iznesete načelo na kojem se temelji svaki eksperiment: model određuje domet tvrdnje.

Rezultat u crvu tvrdnja je o crvu. Rezultat u ličinki ribe tvrdnja je o ličinki ribe. Nijedan nije tvrdnja o pacijentu dok ga ne podupru podaci o tijeku bolesti u sisavca. Ovaj članak usporedno razmatra dva najčešće citirana rada kako biste vidjeli zašto se njihovi odgovori razlikuju.

Dva eksperimenta u jednoj tablici

Držite ovu tablicu otvorenom dok čitate. U njoj su sažete sve važne razlike između studija.

Razlikuju se genetika, vrste, put primjene, vrijeme početka primjene i ishodi. Genotip je samo jedna od pet razlika, pa ta dva rada ne mogu dokazati da metilensko modrilo djeluje selektivno na jedan put povezan s ALS-om. Dokazuju nešto uže, ali i dalje korisno: izraženo poboljšanje pri ranoj izravnoj izloženosti u jednostavnim modelima nije se prenijelo na tijek bolesti u sisavaca pri kroničnoj oralnoj primjeni.

Pozitivan rezultat: što je pokazala studija na crvima i ribama

U studiji na crvima i ribama iz 2012. mutantni ljudski TDP-43 ili FUS eksprimirani su u motoričkim neuronima crva, a mRNA za mutantne ljudske proteine ubrizgana je u riblje embrije. To su modeli proteotoksičnosti. Oni tijekom nekoliko dana reproduciraju toksične učinke mutantnog proteina na kretanje i oblik neurona, a ne cjelokupan višegodišnji tijek ALS-a u odraslih ljudi.

Primjena je započela vrlo rano. Crvi su od izlijeganja rasli na agaru koji je sadržavao metilensko modrilo. Riblji embriji bili su preko noći u otopini lijeka, počevši 24 sata nakon oplodnje, a ponašanje je ispitano otprilike dva dana poslije. Krvno-moždana barijera nije stajala između lijeka i neurona na način na koji stoji u sisavca, a koncentracija lijeka u plazmi ili mozgu nije mjerena.

U tim su uvjetima učinci bili veliki i dosljedni. I 6 i 60 μM smanjili su paralizu povezanu s dobi u crvima s TDP-43 i FUS. Na 12. dan odrasle dobi otprilike 80 posto netretiranih crva s TDP-43 bilo je paralizirano, u usporedbi s oko 10 posto crva tretiranih od izlijeganja. Sinaptički test pokazao je isti smjer: crvi s TDP-43 bili su preosjetljivi na aldikarb, lijek kojim se ispituje neuromuskularni prijenos, a metilensko modrilo pomaknulo je odgovor prema normalnom. Broj degenerirajućih izdanaka motoričkih neurona smanjio se, uz najjasniji učinak pri 60 μM. U ribama se plivanje izazvano dodirom znatno poboljšalo, a skraćeni motorički aksoni pri 30 ili 60 μM narasli su prema normalnoj duljini, iako je oporavak bio djelomičan, a ne potpun.

Podaci o oksidativnom stresu u skladu su s tumačenjem o antioksidativnom djelovanju. Mutantni crvi i ribe imali su povišene pokazatelje reaktivnih kisikovih vrsta koji su se smanjili uz primjenu, a normalni crvi izloženi metilenskom modrilu preživjeli su prooksidativni izazov mnogo dulje od netretiranih crva. No važna su dva ograničenja. Ukupne razine mutantnih proteina TDP-43 i FUS nisu se smanjile, a studija nije izravno kvantificirala proteinske agregate, pa pokazuje funkcionalno poboljšanje bez dokaza o uklanjanju agregata. Svatko tko prati uobičajeno oblikovanje hipoteza o redoks-procesima i mitohondrijima trebao bi taj mehanizam smatrati potkrijepljenim, ali ne i konačno utvrđenim.

Vrijeme početka primjene bilo je najpoučniji detalj. Kada su autori pričekali do 5. dana odrasle dobi da započnu primjenu, stopa paralize na 12. dan iznosila je oko 55 posto, umjesto oko 10 posto uz primjenu od izlijeganja. Isti lijek, isti crv, ista mutacija, mnogo manji učinak. Rana profilaktička izloženost bila je zaslužna za velik dio opažene koristi.

Rezultat bez značajnog učinka: što je pokazala studija na miševima sa SOD1

Studija na miševima iz 2011. postavila je teže pitanje u strožem sustavu. U kongenih miševa sa SOD1 G93A bolest napreduje od drhtanja stražnjih udova preko poremećaja hoda i gubitka refleksa uspravljanja do unaprijed definiranog završnog ishoda. Primjena je započela prije pojave simptoma, na 45. dan, i nastavila se svakodnevno, dok su promatrači neurološko stanje ocjenjivali na ljestvici od 0 do 6. Taj eksperiment obuhvaća cjelokupan tijek bolesti, zbog čega je bliži onome što bi pacijentu bilo važno nego bilo koja krivulja paralize u crvu.

Glavni rezultati nisu pokazali značajan učinak. Ukupni početak bolesti nastupio je nakon 121 dana u kontrolnoj skupini, nasuprot 124 dana uz metilensko modrilo, a razlika nije bila značajna. Preživljenje do završnog stadija iznosilo je 167 dana nasuprot 170 dana, također bez značajne razlike. Nekoliko sekundarnih analiza išlo je u prilog primjeni: u ženki je početak bolesti bio odgođen za oko 7 dana, a tretirane životinje provele su nešto više vremena u blažim stadijima i manje u težima. S obzirom na male podskupine prema spolu i brojne usporedbe stadija, ti nalazi služe za postavljanje hipoteza, a ne kao dokaz. Nisu mjereni broj neurona, agregacija SOD1 ni oksidativni ili upalni biljezi, pa studija također ne može razjasniti je li lijek dosegnuo svoje ciljeve i nije djelovao ili pri toj dozi uopće nije djelovao na njih. Ispitana je samo jedna doza.

Sami autori istaknuli su najvažnije ograničenje, koje vrijedi u oba smjera. SOD1 G93A s velikim brojem kopija dobro modelira bolest uzrokovanu toksičnim SOD1, ali bolest povezana sa SOD1 čini mali dio obiteljskog ALS-a i ima drukčiju biologiju od većine sporadičnih slučajeva. Predložili su ponovno ispitivanje kandidata u modelima sisavaca temeljenima na TDP-43. Taj je prijedlog otad postao složeniji jer autori studije na crvima i ribama navode da ni zasebna studija metilenskog modrila na miševima s TDP-43 nije poboljšala motoričke ishode. Spoj stoga može pokazati snažan učinak u jednom sustavu TDP-43, a nikakav u drugom. Sustav je važan koliko i gen.

Zašto poboljšanje u crvu ili ribi ne može potvrditi korist za pacijente

Promatrajte svaki model kao odgovor na drukčije pitanje.

Prvo, biologija se razlikuje. TDP-43 i FUS proteini su koji vežu nukleinske kiseline i imaju zajedničke genetičke interakcije u tim jednostavnim sustavima, dok toksičnost SOD1 djeluje putem djelomično različitih neposrednih mehanizama. Lijek koji ublažava jedan proteotoksični stres ne mora ublažiti drugi, a uspjeh protiv prekomjerne ekspresije u embriju ne mora predvidjeti uspjeh protiv spore neurodegeneracije u odrasloj dobi, uz upalu, uključenost glije i sustavno propadanje.

Drugo, izloženost se razlikuje. Kontinuirana izloženost putem okolnog medija pri mikromolarnim koncentracijama nije isto što i oralna primjena. Između progutane doze i motoričkog neurona u kralježničnoj moždini nalaze se apsorpcija u crijevima, metabolizam prvog prolaska, vezanje za proteine plazme, prodor u mozak i klirens. Nijedna studija nije mjerila koncentracije lijeka u živčanom sustavu, pa nijedna ne može povezati svoju koncentraciju s koncentracijom u drugoj studiji.

Treće, vrijeme početka primjene se razlikuje. Koristi u crvima i ribama uvelike su ovisile o primjeni prije nakupljanja patoloških promjena. Primjena u miševima također je započela prije pojave simptoma, što je prednost, no u ljudi bi liječenje gotovo uvijek započelo nakon pojave simptoma, dakle još kasnije. Profilaktički signal u dvodnevnom testu na embrijima polazište je za istraživanje, a ne model kliničke primjene.

Četvrto, ishodi se razlikuju. Paraliza nakon 12 dana, osjetljivost na aldikarb, duljina aksona u mikrometrima i prijeđena udaljenost pri plivanju neposredni su fenotipski pokazatelji. Početak bolesti i preživljenje u sisavca objedinjuju sve kompenzacijske procese i procese koji kompliciraju tijek bolesti u tijelu. Lijekovi često mijenjaju neposredne pokazatelje bez promjene preživljenja, zbog čega postoje ishodi koji mjere vrijeme do događaja u sisavaca.

Čitatelji koji žele kontrolni popis za sljedeći naslov mogu ga preuzeti iz članka kako čitati pretkliničke studije: provjerite vrstu, transgen, dozu i put primjene, jesu li mjerene koncentracije lijeka, kada je primjena započela u odnosu na razvoj patoloških promjena, je li ishod bio kratkoročni fenotip ili tijek bolesti te je li učinak ponovljen u drugom laboratoriju. Širi skup dokaza o metilenskom modrilu u ljudi i dalje je mjesto na kojem treba provjeriti jesu li neki od tih ranih signala prerasli u kliničke podatke.

Što to znači za pacijente i obitelji

Iz tih radova ne proizlazi nikakav utemeljen protokol primjene metilenskog modrila za ALS. Pozitivna studija podupire daljnja istraživanja oksidativnih i sinaptičkih mehanizama u biologiji TDP-43 i FUS. Studija bez značajnog učinka ne podupire očekivanje promjene tijeka bolesti pri kroničnoj oralnoj primjeni uz tu izloženost u bolesti tipa SOD1. Zajedno opisuju nedosljednost među modelima, a ne preporuku liječenja.

Sigurnost zahtijeva jednako trezven pristup kao i djelotvornost. Studije ALS-a na miševima ne govore ništa o sigurnom doziranju u ljudi, a metilensko modrilo nosi stvarne rizike od hemolize kod manjka G6PD i serotoninske toksičnosti u kombinaciji sa serotonergičkim lijekovima. Sumnja na manjak G6PD, trenutačna uporaba antidepresiva i svaka planirana promjena terapije teme su za razgovor s liječnikom, kao i pregled općih podataka o sigurnosti metilenskog modrila prije nego što itko poduzme nešto na temelju naslova o laboratorijskim nalazima.

Zaključak stane u jednu rečenicu. Metilensko modrilo pri ranoj izloženosti izazvalo je izraženo poboljšanje fenotipova u crvima i ribljim ličinkama s TDP-43 i FUS, a u studiji kronične oralne primjene na miševima sa SOD1 nije donijelo gotovo nikakvu korist u pogledu početka bolesti ili preživljenja, pa je pošteno tumačenje da su dokazi ovisni o modelu i ne podupiru primjenu u pacijenata.