मिथिलीन ब्लू और Bartonella: प्रयोगशाला के निष्कर्ष और नैदानिक प्रमाण की सीमाएँ

कल्चर डिश और रोगी, दोनों के लिए संक्रमण शब्द इस्तेमाल होता है, लेकिन दोनों में उसका अर्थ एक जैसा नहीं है। डिश में संक्रमण का माप अगर पर कॉलोनियों की संख्या है। रोगी में इसका अर्थ कोशिकाओं और रक्त वाहिकाओं के भीतर मौजूद बैक्टीरिया, रक्त और ऊतकों में पहुँचती दवाएँ, और इस प्रक्रिया में अपना हिस्सा निभाती प्रतिरक्षा प्रणाली है। इन दोनों को एक मान लेने पर प्रयोगशाला का कोई उल्लेखनीय आँकड़ा उपचार जैसा दिखने लगता है। इन्हें अलग रखने पर वही आँकड़ा अपने वास्तविक अर्थ में सामने आता है: अगला प्रयोग करने का एक कारण।

मिथिलीन ब्लू और Bartonella की इस समीक्षा का पूरा उद्देश्य यही अंतर स्पष्ट करना है। एक ही शोध समूह के दो प्रयोगशाला अध्ययनों ने वृद्धि न कर रहे Bartonella henselae के विरुद्ध मिथिलीन ब्लू का परीक्षण किया। दोनों ने काँच और प्लास्टिक के प्रयोगशाला पात्रों में प्रबल सक्रियता की सूचना दी। किसी भी अध्ययन में किसी व्यक्ति पर परीक्षण नहीं किया गया।

शोधकर्ता स्थिर अवस्था का परीक्षण क्यों करते हैं

अधिकांश एंटीबायोटिक परीक्षण बढ़ती हुई कोशिकाओं पर किए जाते हैं। यह मॉडल एक कठिन स्थिति को नहीं पकड़ता: ऐसी कोशिकाएँ जिन्होंने विभाजित होना बंद कर दिया है और जो उन दवाओं को सहन कर लेती हैं जो उनकी बढ़ती हुई समकक्ष कोशिकाओं को मार देती हैं।

Bartonella शरीर में बना रह सकता है, जिसमें लाल रक्त कोशिकाओं और एंडोथीलियल कोशिकाओं के भीतर भी शामिल है। इसलिए समूह ने यह जाँचा कि स्थिर अवस्था में पहुँचने के बाद B. henselae को कौन-सी अनुमोदित दवाएँ मार सकती हैं। बढ़ती हुई कोशिकाओं के विरुद्ध कम MIC से स्थिर अवस्था की कोशिकाओं के मारे जाने का अनुमान नहीं लगाया जा सका। रिफैम्पिन का MIC बहुत कम था, फिर भी उसने स्थिर अवस्था की कोशिकाओं को कम प्रभावी ढंग से मारा, जबकि अधिक MIC वाले यौगिकों ने उन्हें प्रभावी ढंग से मारा। इस तरह के शोधपत्र को पढ़ने की सामान्य विधि चाहने वाले पाठक उसे मिथिलीन ब्लू शोध पढ़ने की मार्गदर्शिका में पाएँगे।

पहला प्रारंभिक परीक्षण: Li और सहकर्मी, 2019

Antibiotics में प्रकाशित 2019 के स्थिर अवस्था संबंधी प्रारंभिक परीक्षण में केवल एक स्ट्रेन, B. henselae JK53, का इस्तेमाल किया गया। इसे Schneider माध्यम में 10 प्रतिशत भ्रूणीय गोवंशीय सीरम के साथ 37 C पर 5 प्रतिशत CO2 की उपस्थिति में उगाया गया। एक दिन पुराने कल्चर में मुख्यतः अलग-अलग फैली हुई, विभाजित होती कोशिकाएँ थीं। पाँच दिन पुराने कल्चर को स्थिर अवस्था का माना गया। इनमें प्रति mL लगभग 10 की घात 8 कॉलोनी बनाने वाली इकाइयाँ थीं और दिखाई देने वाले कोशिका समूह मौजूद थे।

परीक्षण में प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ SYBR Green I इस्तेमाल किया गया। इसे जीवित कोशिकाओं और आइसोप्रोपेनॉल से मारी गई कोशिकाओं के मिश्रणों के आधार पर कैलिब्रेट किया गया। मिथिलीन ब्लू का रंग गहरा होने के कारण, संभावित सक्रिय दवाओं की पुष्टि पहले माइक्रोस्कोपी से और फिर ब्लड अगर पर कॉलोनी गणना से की गई। कॉलोनी गणना अधिक कठोर मूल्यांकन मानदंड था।

50 माइक्रोमोलर पर जाँची गई 1,581 अनुमोदित दवाओं में, मिथिलीन ब्लू के बाद प्लेट रीडर के अनुसार 16 प्रतिशत और माइक्रोस्कोपी के अनुसार 25 प्रतिशत कोशिकाएँ जीवित बचीं। डैप्टोमाइसिन के लिए यह आँकड़ा 21 प्रतिशत, कई एज़ोल दवाओं के लिए 22 से 27 प्रतिशत, जेंटामाइसिन के लिए 32 प्रतिशत, एरिथ्रोमाइसिन के लिए 66 प्रतिशत और सिप्रोफ्लोक्सासिन के लिए 74 प्रतिशत था। प्लेट रीडर पर पिर्विनियम पामोएट अधिक प्रभावी दिखा, लेकिन उसकी अपनी प्रतिदीप्ति के कारण माइक्रोस्कोपी से उसका आकलन नहीं किया जा सका।

बढ़ते हुए B. henselae के विरुद्ध मिथिलीन ब्लू का MIC प्रति mL 0.08 से 0.16 माइक्रोग्राम था। पाँच दिन पुरानी स्थिर अवस्था की कोशिकाओं पर प्रति mL 5 माइक्रोग्राम की सांद्रता में एक दिन के संपर्क के बाद कोई कॉलोनी नहीं मिली। परीक्षण की गई सांद्रताओं पर डैप्टोमाइसिन और पिर्विनियम पामोएट के परिणाम भी ऐसे ही थे। समय के साथ कोशिकाओं के मारे जाने के एक अलग परीक्षण में प्रति mL 10 माइक्रोग्राम इस्तेमाल किया गया। ये प्रयोगशाला में संपर्क की सांद्रताएँ हैं, खुराकें नहीं, और शोधपत्र इन्हें इसी रूप में प्रस्तुत करता है। मनुष्यों में प्लाज़्मा की अधिकतम सांद्रता के लिए उद्धृत प्रति mL लगभग 3.9 माइक्रोग्राम का मान शोधपत्र में केवल पृष्ठभूमि संदर्भ के रूप में दिया गया है। मिथिलीन ब्लू के फार्माकोकिनेटिक्स का अवलोकन समझाता है कि प्लाज़्मा के किसी मान को ऊतक का मान क्यों नहीं माना जा सकता।

शोधपत्र में दो सीमाएँ स्पष्ट हैं। इसमें कोई बायोफिल्म मॉडल नहीं था और मिथिलीन ब्लू के किसी संयोजन का परीक्षण नहीं हुआ था। पाँच दिन पुराने कोशिका समूह स्थिर अवस्था के तरल कल्चर में बने समूह थे, किसी मान्य बायोफिल्म प्रयोग का हिस्सा नहीं। लेखकों ने पशु अध्ययन, संयोजन परीक्षण, बायोफिल्म अध्ययन और Bartonella की अन्य प्रजातियों में परीक्षण की आवश्यकता बताई।

संयोजन और बायोफिल्म से प्राप्त कोशिकाएँ: Zheng और सहकर्मी, 2020

BMC Microbiology में प्रकाशित 2020 के अनुवर्ती अध्ययन में वही स्ट्रेन और माध्यम रखा गया, लेकिन छह दिन पुराने स्थिर अवस्था के कल्चर इस्तेमाल किए गए। इसमें पहले शोधपत्र में अनुपस्थित दो चीज़ें जोड़ी गईं: दो दवाओं के संयोजन और बायोफिल्म से प्राप्त कोशिकाओं का मॉडल।

अलग-अलग दवाओं को एक समान प्रति mL 5 माइक्रोग्राम की सांद्रता पर 24 घंटे तक इस्तेमाल करने पर, मिथिलीन ब्लू के बाद प्रति mL 3.2 गुणा 10 की घात 4 कॉलोनी बनाने वाली इकाइयाँ बचीं। नियंत्रण समूह में यह संख्या लगभग 2.8 गुणा 10 की घात 10 थी। उसी समय-बिंदु पर सिप्रोफ्लोक्सासिन, जेंटामाइसिन और नाइट्रोफ्यूरैन्टोइन के बाद कम कॉलोनियाँ बचीं। यह 2019 के परिणाम से अलग है, जहाँ इसी नाममात्र सांद्रता पर एक दिन बाद कोई कॉलोनी नहीं मिली थी। कल्चर की आयु, घनत्व और उसे सँभालने की विधि अलग थीं, इसलिए कोशिकाओं के मारे जाने की दिशा दोहराई जा सकी, लेकिन उसका परिमाण एक जैसा नहीं था। अलग-अलग परीक्षणों में यह बदलाव एक कारण है कि मानक सुरक्षा और दवा अंतःक्रिया जाँच में प्रयोगशाला की सक्रियता को नैदानिक प्रभाव से अलग माना जाता है।

संयोजन परीक्षण इस अध्ययन का सबसे अधिक उद्धृत हिस्सा है। हर घटक की सांद्रता प्रति mL 5 माइक्रोग्राम पर निश्चित रखी गई थी। एज़िथ्रोमाइसिन के साथ मिथिलीन ब्लू और रिफैम्पिन के साथ मिथिलीन ब्लू, दोनों के बाद 24 घंटे पर स्थिर अवस्था की कोई कॉलोनी नहीं मिली। सिप्रोफ्लोक्सासिन वाले दोनों संयोजनों में भी यही परिणाम मिला। परीक्षण किए गए 25 संयोजनों में केवल इन चार में ऐसा हुआ। कोई औपचारिक सहक्रियात्मकता विश्लेषण नहीं किया गया था, इसलिए सही शब्दावली है इन परिस्थितियों में सक्रिय संयोजन, सिद्ध सहक्रियात्मकता नहीं।

बायोफिल्म प्रयोग में शुरुआती अवस्था की तोड़ी गई बायोफिल्म से निकाली गई कोशिकाओं का परीक्षण किया गया था, किसी अक्षुण्ण परिपक्व बायोफिल्म में दवा के प्रवेश का नहीं। कल्चर को पाँच दिन तक उगाया गया, फिर तनु करके वेल प्लेटों में पाँच और दिन रखा गया। क्रिस्टल वायलेट से रंगने के बाद बायोफिल्म की पुष्टि की गई और दवा के संपर्क से पहले उसे खुरचकर निकाला गया। प्रति mL 5 माइक्रोग्राम पर, केवल मिथिलीन ब्लू के इस्तेमाल से दिन 6 तक संख्या घटकर 2.3 गुणा 10 की घात 2 रह गई। यह अलग-अलग दवाओं में सबसे अच्छे परिणामों में से एक था, लेकिन शून्य नहीं था। मिथिलीन ब्लू वाले दोनों संयोजनों में दिन 6 तक संख्या शून्य हो गई, और सिप्रोफ्लोक्सासिन वाले दोनों संयोजनों में भी ऐसा हुआ।

लेखकों ने वही सीमाएँ बताईं जिन्हें कोई सावधान पाठक पहचानेगा: पुरानी अक्षुण्ण बायोफिल्म के बजाय शुरुआती अवस्था की खुरची गई बायोफिल्म; हर दवा की अपनी यथार्थवादी अधिकतम सांद्रता के बजाय सभी दवाओं के लिए एक सुविधाजनक सांद्रता; केवल एज़िथ्रोमाइसिन या रिफैम्पिन पर केंद्रित चुनिंदा संयोजन; एक स्ट्रेन; कोई पशु परीक्षण नहीं; कोई रोगी परीक्षण नहीं। बाद में तीन दवाओं वाले संयोजनों पर काम प्रस्तावित किया गया था, उसके परिणाम रिपोर्ट नहीं किए गए थे।

अध्ययन की रूपरेखाओं की तुलना

यह तालिका इस लेख के मुख्य बिंदु को संक्षेप में प्रस्तुत करती है। अंतिम कॉलम के बाईं ओर की हर चीज़ कल्चर पर किया गया काम है। दोनों में से किसी भी शोधपत्र की कोई जानकारी अंतिम कॉलम में नहीं आती।

Bartonella, Borrelia नहीं है

दोनों शोधपत्र Lyme रोग के स्पाइरोकीट Borrelia burgdorferi का उल्लेख करते हैं, क्योंकि रंग-आधारित परीक्षण उसी प्रयोगशाला में स्थिर अवस्था के Borrelia पर किए गए पहले के काम से आया था। उस काम में भी मिथिलीन ब्लू और डैप्टोमाइसिन संभावित सक्रिय दवाओं के रूप में सामने आए थे। यह इतिहास उपयोगी संदर्भ है और भ्रम का एक सामान्य स्रोत भी।

Bartonella के किसी भी शोधपत्र में ऐसा कोई प्रयोग नहीं है जो Borrelia और Bartonella का साथ-साथ परीक्षण करता हो। जीव अलग हैं, माध्यम अलग हैं, सांद्रताएँ अलग हैं, और Bartonella में मिथिलीन ब्लू के अनुमानित झिल्ली संबंधी प्रभाव को अधिक अध्ययन की आवश्यकता वाली परिकल्पना के रूप में बताया गया था। परिणामों को एक प्रजाति से दूसरी पर लागू नहीं करना चाहिए, और कोई भी शोधपत्र परजीवियों के बारे में व्यापक दावों का समर्थन नहीं करता। Borrelia और Bartonella की दवा-सहनशील पर्सिस्टर कोशिकाओं की तुलना इसी कारण दोनों के शोध साहित्य को अलग रखती है।

कल्चर के परिणाम उपचार प्रोटोकॉल क्यों नहीं बन जाते

मिथिलीन ब्लू और Bartonella के उपचार प्रोटोकॉल को खोजने में रुचि होना समझ में आता है। इन्हीं शोधपत्रों के कारण इस वाक्यांश को खरीदारी की सूची के बजाय सावधानी के संकेत के रूप में देखा जाना चाहिए।

पहला, किसी वेल में प्रति mL 5 माइक्रोग्राम की सांद्रता कोई चिकित्सकीय पर्चा नहीं है। इससे अवशोषण, वितरण, प्रोटीन से बंधन, कोशिकाओं के भीतर प्रवेश या सहनीयता की कोई जानकारी नहीं मिलती। लेखकों ने इसे एंटीबायोटिक दवाओं की अधिकतम सांद्रताओं के मोटे औसत के रूप में चुना था और कहा था कि भविष्य के काम में हर दवा को उसकी अपनी यथार्थवादी सांद्रता पर इस्तेमाल करना चाहिए।

दूसरा, शून्य कॉलोनियों का अर्थ है कि प्लेट पर उगाने की उन परिस्थितियों में कोई कॉलोनी नहीं मिली, यह नहीं कि ऊतक जीवाणुरहित हैं। पर्सिस्टर कोशिकाएँ, कोशिकाओं के भीतर मौजूद बैक्टीरिया और नमूना लेने की सीमाएँ, सभी अगर प्लेट के दायरे से बाहर हैं।

तीसरा, किसी वेल को जीवाणुरहित करने वाले संयोजन शरीर में विफल हो सकते हैं या नुकसान पहुँचा सकते हैं। एज़िथ्रोमाइसिन के साथ मिथिलीन ब्लू और रिफैम्पिन के साथ मिथिलीन ब्लू, प्रयोगशाला की संपर्क सांद्रताओं पर जाँचे गए प्रयोगशाला संयोजन हैं। पशुओं में फार्माकोकिनेटिक्स और मनुष्यों में नियंत्रित अध्ययन के आँकड़ों के बिना कोई खुराक, अवधि या लाभ-जोखिम अनुपात स्थापित नहीं है। विकल्पों पर विचार करने वाले किसी भी व्यक्ति को चिकित्सक से उनकी चर्चा करनी चाहिए और डिश के आँकड़ों से कोई निष्कर्ष निकालने से पहले यह पढ़ना चाहिए कि मिथिलीन ब्लू के इस्तेमाल में चिकित्सकीय निगरानी कब आवश्यक होती है।

इन शोधपत्रों से समर्थित सीमित निष्कर्ष यह है: मिथिलीन ब्लू प्रयोगशाला में वृद्धि न कर रहे B. henselae JK53 के विरुद्ध ऐसी सक्रियता दिखाता है जिसे दोहराया जा सकता है। इसमें दो दवाओं वाले प्रयोगशाला संयोजन भी शामिल हैं, और संयोजनों तथा बायोफिल्म से प्राप्त कोशिकाओं के लिए सबसे मजबूत परिणाम 2020 के अध्ययन से आए हैं। बाकी सभी बातें, जिनमें यह भी शामिल है कि मनुष्यों में बार्टोनेलोसिस के लिए इस सक्रियता का कोई महत्व है या नहीं, अभी परीक्षण से परे हैं।