मेथिलीन ब्लू का अवशोषण स्पेक्ट्रम और मोलर अवशोषकता: मापन स्थितियों सहित संदर्भ

मेथिलीन ब्लू का स्पेक्ट्रम तब तक सरल लगता है, जब तक आप उसमें दिए किसी मान को दोबारा इस्तेमाल करने की कोशिश नहीं करते। एक प्रयोगशाला लगभग 82,000 का मोलर विलोपन गुणांक बताती है। दूसरी 67,000 बताती है। तीसरी 100,000 से अधिक बताती है। ये तीनों अपने-अपने मापनों के सही विवरण हो सकते हैं, और इनमें से कोई भी इस रंजक के लिए सार्वभौमिक स्थिरांक नहीं है।

भ्रम दो अलग अवधारणाओं को मिला देने से पैदा होता है। अवशोषणांक किसी विशिष्ट विलयन को किसी विशिष्ट सेल में रखकर किया गया मापन है। मोलर अवशोषकता, जिसे अक्सर एप्सिलॉन लिखा जाता है, उस विलयन के मॉडल का एक प्राचल है। जब मेथिलीन ब्लू की आणविक साहचर्य अवस्था बदलती है, तो मॉडल बदलता है और प्राचल भी बदल जाता है। उपयोगी अभ्यास यह है कि प्रत्येक गुणांक को उसकी स्थितियों सहित दर्ज किया जाए: तरंगदैर्ध्य, विलायक, pH या बफ़र, तापमान, सांद्रता सीमा और प्रकाश पथ की लंबाई उस मान के साथ रहें।

तनु जलीय विलयन में मोनोमर बैंड

तनु जलीय विलयन में मेथिलीन ब्लू धनायन का प्रमुख बैंड लगभग 664 से 665 nm पर होता है। उपकरणों और अंशांकन के विकल्पों के अनुसार इसे आम तौर पर 664 से 668 nm के बीच बताया जाता है। जब विलयन इतना तनु हो कि अधिकांश रंजक मोनोमर के रूप में मौजूद हो, तो मात्रात्मक निर्धारण के लिए यही बैंड सही विकल्प है।

साहित्य में दिए गए तीन मान दिखाते हैं कि मुख्य संख्या से अधिक महत्व मापन की स्थितियों का है। क्ले पर शोध करने वाले शोधकर्ताओं ने 1 cm सेल में जलीय नमूनों की सांद्रता लगभग 7 micromolar से नीचे रखी और 665 nm पर लगभग 82,000 M-1 cm-1 का एप्सिलॉन बताया। अत्यंत तनु जलीय नमूनों के लिए अनुभवजन्य अंशांकन ढाल के रूप में यह मान विशेष रूप से अच्छी तरह प्रलेखित है। बाद में किए गए विआयनीकृत जल में प्राथमिक अंशांकन में 2.34 से 37.52 micromolar और 1 cm प्रकाश पथ का उपयोग किया गया। इसमें कुल रंजक के लिए 665 nm पर लगभग 67,100 M-1 cm-1 मिला। यह कम परिणाम अपेक्षित है, विरोधाभासी नहीं, क्योंकि उस अंशांकन सीमा के ऊपरी आधे हिस्से में पहले से ही उल्लेखनीय मात्रा में डाइमर मौजूद होता है। तीसरा मान, 664 nm पर लगभग 73,460 M-1 cm-1, pH 6.86 और 293 K पर किए गए कार्य से आता है। उसमें प्रेक्षित स्पेक्ट्रम को मोनोमर और डाइमर के हिस्सों में अलग किया गया था, जैसा कि मेथिलीन ब्लू की प्रकाशभौतिकी की हाल की आलोचनात्मक समीक्षा में संक्षेपित है। यह मान डीकन्वोल्यूशन से अलग किए गए मोनोमर घटक का है, कुल रंजक के सापेक्ष अवशोषणांक की प्रत्यक्ष ढाल नहीं है।

व्यावहारिक बात: ऐसा गुणांक चुनें जिसकी स्थितियाँ आपके नमूनों से मेल खाती हों, या अपना अंशांकन करें। 30 micromolar फॉस्फेट बफ़र परीक्षण में 82,000 का मान इस्तेमाल करके यह न मान लें कि रैखिकता अब भी बनी हुई है।

कम तरंगदैर्ध्य वाला शोल्डर एक मिश्रण है

सांद्रता बढ़ने पर 600 से 615 nm के पास का शोल्डर, 664 nm के शिखर की तुलना में बढ़ता है। आधुनिक अध्ययनों में H प्रकार के डाइमर का योगदान आम तौर पर 605 से 610 nm के पास रखा जाता है। जल में मेथिलीन ब्लू का वैश्विक स्पेक्ट्रमी विश्लेषण डाइमर का अधिकतम 607 nm पर और उच्चतर समुच्चय का अधिकतम 600 nm पर अलग करता है। इसमें मोनोमर के अनुनाद घटक 664 और 650 nm पर हैं। इसका पूरा पाठ PMID 33251415 के मुक्त अभिगम रिकॉर्ड के माध्यम से उपलब्ध है।

उस शोल्डर को शुद्ध डाइमर का अवशोषणांक नहीं कहना चाहिए। मोनोमर की कंपन-इलेक्ट्रॉनिक संरचना भी उसी क्षेत्र में योगदान देती है, इसलिए मापी गई ऊँचाई कई योगदानों का अध्यारोपण है। एक वैश्विक फिट में पाया गया कि मोनोमर और डाइमर का मॉडल पूरी 1.1 micromolar से 3.4 millimolar सीमा में उपयुक्त नहीं था। टेट्रामर जोड़ने पर सबसे अच्छा फिट मिला, और टेट्रामर का संकेत 34 micromolar से नीचे भी पहचाना जा सकता था। फिट किए गए घटकों की अवशोषकता के मान बड़े थे: मुख्य मोनोमर घटक के लिए 664 nm पर लगभग 107,800 M-1 cm-1, डाइमर के लिए 607 nm पर लगभग 101,400 और टेट्रामर के लिए 600 nm पर लगभग 138,500। ये मान बिना बफ़र वाले विआयनीकृत जल में, 0 से 0.15 M सोडियम क्लोराइड और 282 से 333 K तापमान पर मिले थे। ये मॉडल से अलग किए गए हिस्से हैं, इसलिए इन्हें अनुभवजन्य बीयर-लैम्बर्ट ढाल के स्थान पर इस्तेमाल नहीं करना चाहिए।

डाइमरीकरण की प्रवृत्ति का प्रत्यक्ष मात्रात्मक निर्धारण किया गया है। pH 6.86 और 293 K पर एक अध्ययन में लगभग 3,900 M-1 का डाइमरीकरण स्थिरांक मिला। यह परिमाण समझाता है कि 5 micromolar कार्यशील विलयन लगभग रैखिक व्यवहार क्यों करता है, जबकि 50 micromolar स्टॉक विलयन ऐसा क्यों नहीं करता। विधि विकसित करते समय एक उपयोगी जाँच है: लगभग 610 nm के अवशोषणांक का लगभग 665 nm के अवशोषणांक से अनुपात। जब यह अनुपात सांद्रता के साथ बढ़ता है, तो 664 nm पर एप्सिलॉन अब किसी एक अपरिवर्तित रासायनिक प्रजाति का वर्णन नहीं करता।

ऐसी सांद्रता सीमा में, जहाँ परस्पर परिवर्तित होने वाली दो रासायनिक प्रजातियों का एक जोड़ा प्रमुख हो, स्पेक्ट्रमों में एक साझा सम-अवशोषी बिंदु हो सकता है। जलीय विलयनों की शृंखलाओं में प्रयोगात्मक रूप से यह लगभग 625 nm पर पाया जाता है। एक स्पष्ट और स्थिर बिंदु दो प्रमुख रासायनिक प्रजातियों की मौजूदगी के अनुरूप है। जब सांद्रता बढ़ने पर यह बिंदु खिसकता या गायब होता है, तो इसे उच्चतर समुच्चयों के बनने या साम्य बदलने का चेतावनी संकेत मानें, उपकरण की त्रुटि नहीं।

विलायक, pH और तापमान स्पेक्ट्रम को बदलते हैं

जल आणविक साहचर्य को बढ़ावा देता है। जल और DMSO मिश्रणों में मेथिलीन ब्लू के विलायक अध्ययन के अनुसार, डाइमेथिल सल्फ़ॉक्साइड जोड़ने से डाइमरीकरण दबता है, अवशोषण और प्रतिदीप्ति के अधिकतम लंबी तरंगदैर्ध्य की ओर खिसकते हैं, और प्रतिदीप्ति की क्वांटम उपज लगभग चार गुना बढ़ती है। यह अध्ययन PMID 30933781 के रूप में अनुक्रमित है। इसमें जलीय स्पेक्ट्रमों को मोनोमर-डाइमर साम्य के रूप में माना गया है, जिसमें मोनोमर का अवशोषण लगभग 650 से 670 nm और डाइमर का अवशोषण लगभग 580 से 615 nm पर है। इसमें 293.15 K पर स्पेक्ट्रमों से डाइमरीकरण स्थिरांक निकाले गए हैं।

ऐल्कोहॉल बैंड की स्थिति और आभासी अवशोषकता, दोनों को बदलते हैं, लेकिन समुच्चयन को समाप्त नहीं करते। मेथिलीन ब्लू के एक विलायक अध्ययन में बताई गई एक प्राथमिक तुलना में, 31.3 micromolar और कमरे के तापमान पर लंबी तरंगदैर्ध्य वाला अधिकतम जल में 665 nm और मेथनॉल में 655 nm था। पूरे विलयन के आभासी मान जल में लगभग 37,100 और मेथनॉल में 60,800 थे। 298 K पर निर्जल एथनॉल में किए गए एक अलग सत्यापन में अधिकतम 655 nm और एप्सिलॉन लगभग 68,000 मिला।

सामान्य pH परिवर्तन स्पेक्ट्रम को उतना नहीं बदलते, जितना कई प्रोटोकॉल मानते हैं। ऊपर उद्धृत आलोचनात्मक समीक्षा के अनुसार, लगभग pH 2 से pH 12 तक अधिकतम लगभग 665 nm पर बना रहा, और pH 11 तक अवशोषकता में केवल छोटे बदलाव हुए। बफ़र का प्रकार और आयनिक प्रबलता परिणामों को उतना ही बदल सकते हैं, जितना नाममात्र का pH। इसलिए केवल pH मीटर की रीडिंग नहीं, बल्कि वास्तविक बफ़र और लवण भी दर्ज करें। प्रबल अम्ल या प्रबल क्षार एक अलग स्थिति है, क्योंकि इनमें रंजक प्रतिवर्ती साहचर्य के बजाय रासायनिक परिवर्तन से गुजर सकता है। तापमान और लवण भी साम्य को बदलते हैं। इसी कारण 2020 के जलीय अध्ययन में दोनों को जानबूझकर बदला गया था।

ऐसा मापन करें कि मान वैध बना रहे

मात्रात्मक कार्य बीयर-लैम्बर्ट संबंध पर आधारित है: अवशोषणांक, एप्सिलॉन, सांद्रता और प्रकाश पथ की लंबाई के गुणनफल के बराबर होता है। साथ ही यह प्रमाण भी आवश्यक है कि आपकी स्थितियों में रैखिक सीमा वास्तव में लागू होती है।

कम micromolar सांद्रता पर काम करने के लिए 1 cm सेल इस्तेमाल करें। लगभग 82,000 एप्सिलॉन पर, 5 micromolar से लगभग 0.41 और 10 micromolar से लगभग 0.82 अवशोषणांक मिलता है। साधारण जल में मोनोमर पर केंद्रित मापन के लिए लगभग 5 से 7 micromolar या उससे नीचे रहना, कई दसियों micromolar तक अंशांकन करने की तुलना में अधिक भरोसेमंद है। सांद्र स्टॉक विलयनों के लिए 1 से बहुत अधिक अवशोषणांक स्वीकार करने के बजाय प्रकाश पथ छोटा करें।

ब्लैंक के लिए बिल्कुल वही माध्यम इस्तेमाल करें: जल का वही ग्रेड, सह-विलायक का वही अंश, वही बफ़र और लवण, लेकिन रंजक के बिना। अंशांकन विलयन उसी माध्यम में और उसी तापमान पर तैयार करें। विधि विकसित करते समय केवल एक तरंगदैर्ध्य की रीडिंग लेने के बजाय पूरी दृश्य सीमा का स्कैन करें, आदर्श रूप से लगभग 550 से 750 nm तक। केवल ऊँचाई नहीं, आकार भी देखें। यदि क्रमिक तनुकरण से सामान्यीकृत आकार बदलता है, तो तंत्र का रासायनिक व्यवहार सांद्रता पर निर्भर है। केवल उच्च R-वर्ग मान की तुलना में स्थिर अधिकतम और स्थिर 610 से 665 nm अनुपात, स्वीकार्य सीमा के अधिक मजबूत प्रमाण हैं।

अभिकर्मक का रूप दर्ज करें। व्यावसायिक सामग्री निर्जल मेथिलथायोनिनियम क्लोराइड या ट्राइहाइड्रेट जैसे किसी हाइड्रेट के रूप में हो सकती है। इसलिए स्टॉक विलयन की गणना में इस्तेमाल किया गया मोलर द्रव्यमान बोतल में मौजूद वास्तविक पदार्थ से मेल खाना चाहिए। अकेला यह कदम प्रयोगशालाओं के बीच नाममात्र की मोलर सांद्रताओं में कुछ अंतर समझाता है। यही अनुशासन तब भी लागू होता है, जब परिणाम मात्रात्मक परीक्षण की गणनाओं में इस्तेमाल होते हैं, जब स्पेक्ट्रम फ़ॉर्म्युलेशन की स्थिरता की जाँच में सहायक होते हैं, और जब अशुद्धता प्रोफ़ाइल के कारण शुद्धता और विनिर्देशों की समीक्षा आवश्यक होती है।

मापन स्थितियों सहित सारांश

इस तालिका को प्रयोगशाला रिकॉर्ड के शुरुआती प्रारूप के रूप में इस्तेमाल करें, एक-दूसरे के स्थान पर इस्तेमाल किए जा सकने वाले स्थिरांकों के स्रोत के रूप में नहीं।

इसलिए मेथिलीन ब्लू की अवशोषण तरंगदैर्ध्य का उत्तर छोटा है, लेकिन उसके साथ मापन की स्थितियों का विस्तृत विवरण आवश्यक है। आपने जिस विलयन में, जिस सांद्रता पर शिखर मापा है, उसी का विवरण दें। यह अभ्यास लगभग 664 nm पर मिले किसी एक तनु जलीय मान को गलत सार्वभौमिक स्थिरांक बनने से रोकता है।