Shuɗin methylene don rina DNA da RNA: amfani a gel da membrane

Wani ɗalibi yana gudanar da gel na agarose, ya rina shi da shuɗin methylene, amma bai ga komai a inda yake sa ran ganin tsiri mai haske ba. A wurin aiki na kusa, wani mai bincike bayan digirin digirgir yana rina membrane na Northern da rinin da ke cikin irin wannan kwalbar shuɗi, kuma ya sami tsirorin ribosome masu bayyana sosai cikin mintuna uku. Ɗalibin ya yanke hukuncin cewa gel ɗin bai yi aiki ba. Gel ɗin ya yi aiki. Ayyukan biyu sun bambanta, kuma rini ɗaya yana amsa su da bambancin ƙarfin gano samfur, bambancin rinin bango, da bambancin ƙa'idodin abin da zai biyo baya.

Rina DNA da shuɗin methylene da rina RNA da shuɗin methylene suna amfani da tushen sinadarai ɗaya, amma ba su da manufa ɗaya. A gel, rinin yana nuna yawan sinadarin nucleic acid da ke cikin tsarin gel mai ramuka. A membrane, yana nuna ko canja samfur ya yi nasara da kuma ko an ɗora samfur iri ɗaya a kowace hanya. Da zarar an fahimci wannan bambanci, hanyoyin aiki, iyakokin gano samfur, da iyakokin dacewa da matakan da ke biye suna bayyana.

Amsa a taƙaice

Shuɗin methylene rini ne mai shimfiɗaɗɗen tsarin ƙwayar sinadari kuma mai cajin tabbatacce. Yana ɗaurewa da sinadaran nucleic acid ba tare da haɗin covalent ba, kuma ana iya warware wannan ɗaurin. Hakan yana faruwa ta haɗuwar jan hankalin lantarki zuwa phosphate, kutsawa tsakanin nau'ukan tushe masu haɗuwa, da ɗaurewa a ƙaramin tsagi. Wannan iya warware ɗaurin shi ne muhimmin abu. Ana iya rina tsirori a duba su da hasken da ake iya gani, a adana hotonsu, sannan a cire rinin ko a tsabtace samfurin don cloning, hybridization, ko sake gwaji da probe.

Don rina DNA mai igiyoyi biyu a gel na agarose da shuɗin methylene, daidaitacciyar hanya mai sauri ita ce 0.02 percent w/v (200 micrograms per mL) a ruwa, kimanin mintuna 15 na rina samfur sannan kimanin mintuna 15 na cire rinin da ruwa, a duba shi a kan akwatin farin haske. Ga membrane, tsohuwar hanyar Northern blot tana amfani da rini 0.02 zuwa 0.04 percent a sodium acetate kusa da pH 5.2, a rina na wasu mintuna bayan canja samfur da ɗaure shi a wurinsa, sannan a kurkura da ruwa kuma a cire rinin gaba ɗaya kafin hybridization. Ƙarfin gano samfur ba shi da yawa: daga gomomi zuwa ɗaruruwan nanograms a kowane tsirin gel idan yanayi ya dace, kuma jagororin da suke bayar da ƙiyasin taka-tsantsan suna lissafa 0.5 zuwa 1 microgram. Wannan ya zarce adadin da rinin ethidium bromide da SYBR suke iya ganowa da matakai masu yawa na ninkawa da goma. A membrane, babu iyaka guda ɗaya mai amfani don gano wani nau'in transcript, domin rinin ya fi nuna RNA na ribosome mai yawa da jimillar samfurin da aka ɗora. Kada a maye gurbin kayan kowace daga cikin waɗannan hanyoyin da maganin ƙarin abinci da ake sayarwa a kasuwa. Hanyoyin da aka tabbatar suna dogara da rini mai ingancin nazarin sinadarai, buffer masu takamaiman tsari, da sarrafa samfur ba tare da RNase ba idan RNA yana ciki.

Yadda ɗaurin yake aiki, da inda yake iya ruɗarwa

Tsarin fahimtar da ya fi amfani yana da ɓangarori uku. Na farko, tsarin zoben sinadarin mai cajin tabbatacce yana jan hankali zuwa ƙashin bayan phosphate mai cajin korau. Binciken spectroscopy ya gano cewa wannan tasirin lantarki ne ya fi rinjaye idan gishiri ya yi kaɗan, yayin da ƙirƙirar samfuran lissafi da nazarin motsin ƙwayoyin sinadarai suka nuna cewa kutsawa tsakanin tushe da ɗaurewa a ƙaramin tsagi hanyoyi ne masu ɗorewa ga DNA mai igiyoyi biyu, kamar yadda aka taƙaita a wani binciken spectroscopy na ɗaurin shuɗin methylene da DNA. Na biyu, akwai ɗan fifikon GC, inda samfuran lissafi suka fi nuna fifikon jerin CpG da GpC, kuma gwaje-gwaje suka nuna fifikon ɗaurewa da igiyoyi biyu masu yawan GC a binciken fifikon kutsawar shuɗin methylene tsakanin tushe, amma yana ɗaurewa da igiyoyi biyu na AT ma. Rina samfur na yau da kullum ba ya keɓanta ga wani jerin tushe. Na uku, DNA mai igiya ɗaya da RNA suna ɗaurewa galibi ta jan hankalin lantarki da jeren ƙwayoyin sinadari a kan juna tare da tushen da ake iya kaiwa gare su da sassan igiyoyi biyu. Shi ya sa ƙarfin rinin yake canzawa bisa tsawo, jerin tushe, da tsarin na biyu.

Abubuwa biyu suna biyo baya. Saboda ɗaurin ba na covalent ba ne, ana wanke rinin ya fita. Tsirorin polyacrylamide suna shuɗewa da sauri sai dai idan an ɗaure rinin da gangan, kuma akwai wata hanya ta musamman ta ɗaure rinin dindindin saboda rina samfur na yau da kullum ba ya dawwama, kamar yadda Soto da Draper suka bayyana ga gel na PAGE. Saboda rinin yana sa sinadarai su amsa ga haske, haskaka DNA da aka rina da haske mai ƙarfi na dogon lokaci a gaban oxygen zai iya yin oxidation ga guanine, daga baya kuma ya yanke igiyoyin a wasu wurare. An yi cikakken bayani kan wannan tsari a binciken oxidation na guanine da shuɗin methylene ke ƙarfafawa ta haske. Dubawa na ɗan lokaci da farin haske yana kauce wa sananniyar lalacewar UV a hanyoyin gargajiya na ethidium bromide, kuma wannan fa'ida ce ta gaske wajen dawo da samfur don ƙarin aiki. Hasken da ake iya gani ba ya cutarwa sosai kamar UV, amma ba yana nufin ba ya cutarwa ba. A taƙaita lokacin haskakawa idan za a yi cloning da DNA. Don ƙarin bayani kan sinadaran haske da ke bayan wannan taka-tsantsan, duba hanyoyi biyu na sinadaran haske na shuɗin methylene. Don nau'ukan redox guda biyu da yanayin caji waɗanda suke bayyana dalilin da ya sa nau'in da aka yi wa oxidation yake ɗaurewa amma nau'in da aka yi wa reduction ba ya ɗaurewa, duba sinadaran tsarin shuɗin methylene da halayensa.

Aiki na ɗaya: rina samfur a cikin gel

Rina samfur a gel yana amsa tambaya ɗaya: shin akwai isasshen sinadarin nucleic acid a wannan tsirin da ido zai iya gani? DNA mai igiyoyi biyu a agarose shi ne nau'in da aka fi nazarta. Asalin hanyar rina gel da shuɗin methylene ta Flores da abokan aikinsa ta tabbatar da hanyar 0.02 percent mai sauri a agarose 1 percent, kuma ta nuna cewa an samu nasarar dawo da samfur da yin cloning daga baya. Irin wannan hanyar mai samar da kaya tana kan shafin samfurin shuɗin methylene na IBI Scientific, wanda yake jera hanyar membrane ta 0.04 percent da hanyar gel mai sauri kusa da juna.

Matakan aiki:

1. Gudanar da gel kamar yadda aka saba. A rina bayan electrophoresis, ba yayin gudanar da shi ba, sai dai idan an tabbatar da canja samfur ko ƙarfin rarrabewa ga hanyar da aka gyara.
2. Tsoma cikin shuɗin methylene 0.02 percent w/v a ruwan da aka tace ta tururi, tare da motsawa a hankali, na kimanin mintuna 15.
3. Cire rinin ta sauya ruwa sau da yawa, jimillar kimanin mintuna 15, har rinin bangon tsarin gel ya ragu kuma tsirorin suka bayyana.
4. Ɗauki hoto da wuri a kan na'urar farin haske.

Agarose da polyacrylamide suna nuna halaye daban-daban. Agarose yana riƙe rini a tsarin gel, don haka cire rini shi ne matakin da yake ɗaukar lokaci. Siraran gel na polyacrylamide suna karɓar rini da sauri amma suna rasa shi da sauri ma. Wannan yana taimakawa wajen yanke samfur don ƙarin aiki, amma yana rage ingancin bayanan da ake son adanawa na dogon lokaci. Ana iya gano wurin oligonucleotides da aka haɗa ta sinadarai a polyacrylamide da wannan hanyar 0.02 percent cikin mintuna 20 zuwa 30 tare da maimaita wankewa da ruwa, bisa tabbatattun hanyoyin PAGE irin na Current Protocols. An ruwaito hanyoyi masu ƙarancin rini sosai, kusa da 0.0002 percent a TBE da aka tsarma, don oligos da ake shirya wa ƙarin aiki na tsawon sa'o'i da dama, amma hujjojin da ke tallafa musu ba su da ƙarfi sosai.

Bambancin DNA da RNA yana da muhimmanci. DNA mai igiyoyi biyu yana ba da mafi ƙarfi daga ɗaurin da tsarin ƙwayar sinadari ke taimakawa. RNA da DNA mai igiya ɗaya suna karɓar rini, amma ɗaurin ya fi rauni kuma ba a iya hasashen sa sosai. Ga gel na RNA na formaldehyde agarose, yawancin dakunan gwaje-gwaje suna barin rina shuɗi a cikin gel, su fara canja RNA zuwa membrane, sannan su rina a can. Wannan mataki yana maye gurbin alamar gel mai rauni da alamar membrane mafi bayyana, tare da bayanin samfurin da aka ɗora.

Aiki na biyu: rina samfur a kan membrane

Rina samfur a membrane yana amsa wata tambaya dabam: shin canja samfur ya yi aiki, kuma ana iya kwatanta hanyoyin ɗora samfur? Amfanin gargajiya shi ne rinin Northern blot na Herrin da Schmidt wanda za a iya cirewa. Asalinsa rini ne 0.04 percent a sodium acetate 50 mM, a pH 5.0, na mintuna 2 zuwa 3 tare da kurkurawa da ruwa, kuma ana iya cire shi da SDS da aka tsarma a SSPE kafin hybridization.

Sabuwar hanyar da ake amfani da ita sosai tana tafiya kamar haka:

1. Canja RNA ko DNA da aka warware igiyoyinsa zuwa nylon ko nitrocellulose, sannan a ɗaure shi a wurinsa ta haɗawa da UV ko dumama shi domin kada samfurin ya ɓace yayin rina shi.
2. Ba dole ba ne amma an saba: jika membrane a acetic acid 5 percent na kimanin mintuna 15.
3. Rina na mintuna 5 zuwa 10 a shuɗin methylene 0.02 zuwa 0.04 percent a sodium acetate 0.3 zuwa 0.5 M, kusa da pH 5.2.
4. Kurkura kuma a cire rinin da ruwa na mintuna 5 zuwa 15, a adana hoton, sannan a cire ragowar rinin kafin hybridization.

Nylon mai cajin tabbatacce shi ne aka fi amfani da shi a aikin Northern. Nitrocellulose ma yana aiki da wannan tsarin acetic acid tare da acetate. Ana amfani da hoton wajen tabbatar da canja samfur, kwatanta tsirorin 28S da 18S (ko 23S da 16S ga RNA na ƙwayoyin bacteria), nuna wurin ma'aunan tsawo da samfurorin ma'auni, da adana bayanin kusantar daidaita jimillar RNA. Hanyoyin Northern da aka wallafa suna auna tsirorin ribosome da aka rina don duba ɗora samfur, ciki har da binciken kimiyyar madara da ya yi amfani da tsirorin ribosome da aka rina da shuɗin methylene don daidaita ma'auni. Ana iya ganin membrane na Southern ta wannan hanya ma, amma an fi kafa amfani da rinin wajen duba ɗora samfur da canja shi a Northern. Haka kuma, ana warware igiyoyin DNA na Southern kafin canja shi, don haka adadin ƙarfin gano samfur a gel ba ya aiki kai tsaye a nan.

Iyakokin gano samfur da rinin bango: inda shuɗi yake kasa

Kwatancen da ke ƙasa ƙiyasi ne da gangan. Aikin rini yana dogara da kason gel, faɗin tsiri, na'urorin gani, da bin ƙa'idar cire rini. A ɗauki kowane adadi a matsayin ƙiyasin matakin yawa, ba ƙayyadadden ma'auni ba.

Sarrafa rinin bango ne yake tantance ko ana iya amfani da alamar da ba ta da ƙarfi sosai. Rinin da bai ɗaure ba yana da launi mai ƙarfi, don haka bambancin gani yana fitowa ne ta cire rinin da bai ɗaure ba ba tare da cire wanda ya ɗaure ba. Ƙara ƙarfin rini ba kasafai yake ƙara ƙarfin gano samfur ba. Abin da ya fi yi shi ne ƙara lokacin cire rini. Gwada jerin samfurori da aka tsarma a ainihin gel, membrane, da kyamarar da za a yi amfani da su, kuma a yi amfani da zangon da jimillar ƙarfin launi yake ƙaruwa daidai da adadin samfurin da aka ɗora kawai. Shuɗin methylene yana taimaka wa daidaita ɗora samfur ta ƙiyasin adadi. Ba gwajin auna adadi ne mai faɗin zangon awo ba, domin ƙarfin ɗaukar samfur na membrane, ingancin canja samfur, cikar rini, da cire rini suna bambanta daga wata hanya zuwa wata.

Iyakokin dacewa: abin da yake ci gaba da aiki bayan rina samfur

An nuna cewa ana iya yin cloning bayan rina da shuɗi. Flores da abokan aikinsa sun yanke tsirorin agarose da aka rina, suka dawo da DNA, suka haɗa shi da ligation sannan suka shigar da shi cikin ƙwayoyin halitta ta transformation. Sun ruwaito cloning mafi kyau fiye da bayan ethidium bromide tare da UV. Dalilin da ya fi yiwuwa shi ne ƙarancin lalacewa ta haske, ba wata fa'ida daga rinin kansa ba. A taƙaita lokacin fallasa wa farin haske, kuma a tsabtace DNA da aka dawo da shi ta hanyar cire DNA daga gel da aka saba amfani da ita.

Hujjojin PCR da karanta jerin tushe ba su da yawa sosai. Ragowar rini yana ɗaurewa da sinadaran nucleic acid, don haka a cire rinin kuma a tsabtace samfur kafin matakan enzyme. Ana sa ran DNA da aka tsarkake yadda ya kamata daga gel da aka rina da shuɗi zai yi aiki, amma ba a auna sosai yawan ragowar rinin da polymerase daban-daban da sinadaran karanta jerin tushe za su iya jurewa ba. Kada a ɗauka cewa za su jure.

Hybridization na blot yana dacewa idan an bi tsari sosai: canja samfur, ɗaure shi a wurinsa, rina, adana hoto, cire rini, sannan hybridization. Wannan jeri shi ne tsarin Herrin da Schmidt. Rina kafin canja samfur, ko tsallake cire rini, wata hanya ce dabam kuma tana buƙatar tabbatarwa ta kanta. Bayan cire rini, cire probe da sake gwaji da probe bisa hanyoyin da aka saba suna tafiya yadda aka saba. Don rina ƙwayoyin halitta da wannan dangin rini, da dalilin da ya sa tsarin aiki da siririn samfurin da aka ɗaure ba ya aiki kai tsaye ga hanyoyin ƙwayoyin halitta masu rai, duba atlas na rina samfur don microscopy.

Yanke tsiri yana aiki ga agarose da ake shirya wa ƙarin aiki da kuma oligos na PAGE da aka gano da shuɗi, muddin ba a yi amfani da hanyar ɗaure rinin dindindin ba. Fitar da samfur da lantarki bayan cire rini abu ne mai yiwuwa bisa sinadarai ga rinin da ɗaurinsa yake iya warwarewa, amma bayanan gwaje-gwajen sarrafawa kan adadin samfurin da ake samu musamman da shuɗin methylene ba su da yawa. Cire gishiri ko a tara samfur ta precipitation bayan fitar da shi.

Matsalolin da suke maimaituwa

Tsirorin gel marasa bayyana sosai yawanci suna nuna cewa adadin samfur ya yi kaɗan ga rini da ake gani ta launi, musamman ga gajerun samfurori masu igiya ɗaya ko RNA. Ɗora ƙarin samfur, yi amfani da sabon rini, tsawaita lokacin rina kafin ƙara ƙarfin rinin, kuma dakatar da cire rini da wuri. Gel da ya zama shuɗi gaba ɗaya ba tare da bambancin gani ba yawanci yana nuna wuce gona da iri wajen rina ko ƙarancin sauya ruwa. Shuɗewar tsirorin PAGE halin sinadarai ne da ake sa ran gani, ba gazawar rini ba. Ɗauki hoto da sauri. Rashin daidaiton rinin bangon membrane yana nuna ninkewa, kumfar iska, sawun yatsu, motsawa marar daidaito, ko canja samfur a wasu wurare kawai. Kada a fassara hakan a matsayin rashin daidaiton ɗora samfur ba tare da samfurin kulawa na hybridization ba. Tsirorin ribosome masu rauni da yaɗuwa za su iya nuna lalacewa, amma kuma za su iya nuna rashin kammala canja samfur, ƙarancin jimillar RNA (hanyoyin ɗora samfur na yau da kullum suna ɗauke da micrograms da dama zuwa gomomi), ko cire rini fiye da kima. Rinin yana nuna RNA na ribosome mai yawa. Ba ya nuna wani takamaiman transcript. Wannan aikin probe ne.

Aminci da sarrafawa ba tare da ƙara wa magana ba

Shuɗin methylene ya fi sauƙin sarrafawa fiye da ethidium bromide, amma ba marar illa ba ne. Wata takardar bayanan aminci ta MilliporeSigma ta yanzu tana sanya rinin a Category 4 na guba mai tsanani ta baki, mai illa idan aka haɗiye, tare da zubar da shi ta hanyar sharar da aka amince da ita bisa SDS na shuɗin methylene na Sigma-Aldrich. Ethidium bromide yana da gargaɗi mafi tsauri game da cutar da kayan gado, ciki har da zargin illa ga ƙwayoyin haihuwa a SDS na ethidium bromide na Sigma-Aldrich. Haka kuma, ana yawan ware gel da magungunansa a matsayin sharar sinadarai masu haɗari, kamar yadda aka bayyana a jagorar rinin sinadaran nucleic acid ta Thermo Fisher. Bi SDS da ƙa'idodin cibiyar ga duka biyun. A adana busasshen rini a busasshen wuri cikin kwantena da aka rufe sosai, a sake amfani da rinin aiki gwargwadon abin da hanyar aiki ta yarda kawai, a adana membrane da aka rina a bushe tsakanin takardun tacewa, kuma a ɗauki hoton gel kafin tsirorin su bazu su ɓace.

Ka tuna wannan taƙaitacciyar magana ta wurin gwaji. Gel yana gwada ko ana iya ganin samfur mai yawa a ƙarƙashin farin haske. Membrane yana gwada canja samfur da ɗora shi kafin probe ya yi aikin gano samfur kaɗan sosai. Rini ɗaya yana yin duka biyun, tare da ƙarfin gano samfur da bai yi yawa ba, ɗaurin da za a iya warwarewa, da tsauraran ƙa'idodin jerin matakan aiki.