Gina lanƙwasar daidaita awo ta methylene blue: samfuran fanko, zangon ma'auni, da kasancewar layi madaidaici

Masu nazari biyu suna amfani da kwalba ɗaya ta ruwan tushe na methylene blue, kuma kowannensu yana gina lanƙwasar daidaita awo. Na farko yana samun layi madaidaici da ya bi ta mafarin sifili, kuma yana auna samfuran da ba a san maida hankalinsu ba da tabbaci. Na biyu yana samun layin da yake lanƙwasawa a samansa, mahadar layin da ginshiƙi da ba ta kusantar sifili, da sakamakon samfuran da ke sauyawa yayin tsarmawa. Rini ɗaya, na'ura ɗaya, tsawon raƙuman haske ɗaya. Bambancin ba ƙwarewa ba ne. Tsarin gwaji ne: abin da aka saka cikin samfurin fanko, maida hankalin da aka zaɓa, da ko zangon da aka bincika ya kasance cikin yankin da samfurin lissafi mai sauƙi guda ɗaya yake aiki.

Lanƙwasar daidaita awo yarjejeniya ce tsakanin amsar na'ura da maida hankali, wadda take inganta ne kawai a ƙarƙashin yanayin da aka gina ta. Ga methylene blue, wannan yarjejeniya tana da sanannen rauni. Ƙwayoyin rinin suna haɗuwa da juna a cikin ruwa, don haka nau'in sinadarin da ke shanye haske yana sauyawa da maida hankali. Lanƙwasar da aka gina ta ratsa wannan sauyi ba za ta zama madaidaiciya ba, kuma babu yawan nazarin ƙididdiga da zai gyara ta. Wannan labarin yana nuna yadda za a tsara lanƙwasar domin layin ya kasance mai ma'ana: zaɓi samfurin fanko da ya dace, takaita zangon zuwa yankin da monoma ya fi yawa, yi maimaitattun gwaje-gwaje yadda ya kamata, sannan ka ɗauki lanƙwasawa a matsayin bayani maimakon hayaniyar ma'auni.

Fara da samfurin fanko, ba samfuran ma'auni ba

Samfurin fanko yana bayyana sifili, kuma ga methylene blue dole ne ya ƙunshi komai ban da rinin. Matsayin ingancin ruwa ɗaya, sinadarin daidaita pH ɗaya da pH ɗaya, gishirai iri ɗaya, kaso ɗaya na sinadarin narkarwa na haɗin gwiwa, zafin jiki ɗaya. Shirya samfuran daidaita awo a cikin wannan matiriks ɗin iri ɗaya. Dalilin ya shafi sinadarai ne, ba ƙa'idojin gudanarwa ba. Gishiri da sinadarin narkarwa suna sauya daidaiton tsakanin monoma, daima, da manyan tarin ƙwayoyi, wanda hakan yake sauya bakan haske a tsawon raƙuman da ake aunawa. Samfurin fanko na ruwa kaɗai ba zai iya gyara sauyin rarrabuwar nau'o'in sinadari da matiriks ya haifar ba. Nazarin haɗin gwiwa na bakan methylene blue a cikin ruwa, wanda ake samu ta rubutunsa mai damar karantawa kyauta, ya sauya sodium chloride daga 0 zuwa 0.15 M musamman saboda ƙarfin ions yana sauya daidaiton, kuma haɗuwar ƙwayoyi ta ƙaru da gishiri.

Sakamako ɗaya na wannan a aikace: kada ka taɓa daidaita awo a cikin ruwan da aka cire ions sannan ka auna samfurori a cikin sinadarin daidaita pH na phosphate ko tataccen ruwan sharar gida. Idan babu matiriks da ba ya ɗauke da sinadarin da ake nazari, ƙara ma'auni cikin samfurin kansa ya fi amfani da lanƙwasar waje mai matiriks da bai dace ba. Ana samun shawarwari masu alaƙa game da kiyaye sahihancin gwaje-gwajen ruwa a tattaunawar matiriks da tsangwama, kuma an tattauna ƙa'idojin gaba ɗaya na auna adadin rini a taƙaitaccen bayani kan tsara gwaji.

Zaɓi zangon da nau'i ɗaya ya fi yawa

Auna adadi a yankin dogon raƙuman haske kusa da 664 nm yana dogara ne da zato cewa mafi yawan rinin monoma ne. A cikin ruwa marar ƙari, wannan zato yana aiki ne kawai idan ruwan haɗin ya kasance mai ƙarancin maida hankali, kusan a ƙananan matakan micromolar. Gangarorin da aka wallafa daga gwaje-gwaje suna nuna iyakar: daidaita awo da aka takaita ƙasa da kusan 7 micromolar a cikin sel masu 1 cm yana ba da gangara kusa da 82,000 M-1 cm-1, yayin da daidaita awo da aka faɗaɗa zuwa kusan 37 micromolar yake raguwa zuwa kusan 67,100 saboda samfuran ma'aunin sama sun riga sun ƙunshi daima mai yawa. Kowace ƙimar coefficient da aka ambata a nan tana da bayanin yanayinta a tushen bayanin bakan methylene blue, wanda shi ne wurin da ya dace a kwatanta lambobi; wannan labarin yana amfani da su ne kawai don saita zango.

Ƙa'idojin tsarawa suna biyo baya kai tsaye:

1. Ka tabbatar cewa samfurin ma'auni mafi girma yana da ƙarancin maida hankali da zai sa siffar bakan ta tsaya ɗaya. Yayin haɓaka hanyar gwaji, duba duk zangon hasken da ido ke gani (kusan 550 zuwa 750 nm) ga kowane mataki maimakon karanta tsawon raƙuma ɗaya. Idan bakunan da aka daidaita zuwa ma'auni ɗaya suna sauya siffa da maida hankali, yanayin sinadaran yana sauyawa kuma zangon ya yi faɗi sosai.
2. Bibiyi rabon shanyewar haske kusa da 610 nm zuwa shanyewar haske kusa da 665 nm a duk matakan. Rabon da yake ƙaruwa da maida hankali yana nufin kafaɗar daima a bakan tana girma kuma samfurin lissafin monoma yana kasa aiki. An ƙara bayyana wannan hanyar gano matsala a jagorar tasirin haɗuwar ƙwayoyi da maida hankali.
3. Yi amfani da sel mai 1 cm wajen aiki a ƙananan matakan micromolar. Da gangara kusa da 82,000, 5 micromolar yana ba da shanyewar haske kusa da 0.41 kuma 10 micromolar yana ba da kusan 0.82, duka suna cikin zango mai dacewa ga mafi yawan na'urori.
4. Ga ruwan tushe mai yawan maida hankali, rage tsawon hanyar haske maimakon karɓar shanyewar haske da ta zarce 1 sosai, amma ka tuna cewa gajeriyar hanya tana gyara auna haske ne, ba yanayin sinadaran ba. Haɗuwar ƙwayoyi tana dogara da maida hankali, ba tsawon hanyar haske ba, don haka ruwan tushe mai yawan maida hankali har yanzu yana buƙatar hanyar da ta yi la'akari da rarrabuwar nau'o'in sinadari maimakon lanƙwasar monoma mai ƙarancin maida hankali.

Daidaita samfurin lissafi na haɗin gwiwa da ya samar da yawancin wannan fahimtar ya ƙunshi bakuna 224 daga 1.1 micromolar zuwa 3.4 millimolar, kuma ya gano cewa ana iya lura da siginar tetramar tun a ƙasa da 34 micromolar. Wannan sakamakon yana nuna abin da ya kamata a sa a rai: zangon da layi yake madaidaici ya fi ƙanƙanta fiye da yadda zato yake nunawa, don haka ka tabbatar da shi maimakon ɗaukarsa haka kawai.

Matakai, maimaitattun gwaje-gwaje, da jeri

Lanƙwasar da take da maki uku ba ta tabbatar da komai ba. Jagorar tabbatar da inganci a ICH Q2(R2) tana buƙatar aƙalla matakan maida hankali biyar domin tantance kasancewar layi madaidaici, kuma matakai shida zuwa takwas da ba sifili ba suna samar da lanƙwasar aiki mafi gamsarwa, musamman kusa da saman zango inda haɗuwar ƙwayoyi take farawa. Rarraba matakan domin su rufe zangon samfuran da ake son aunawa, tare da ƙarin matakai kusa da inda lanƙwasawa ta fi yiwuwa, ba a cikin jeri mai rabo tsayayye da aka zaɓa don sauƙi ba.

Auna kowane mataki sau biyu ko sau uku, daga shirye-shirye masu zaman kansu maimakon karantawa sau uku daga kwalbar gwaji ɗaya. Maimaitattun shirye-shirye masu zaman kansu suna bayyana kuskuren shiryawa; maimaita karatun kwalba ɗaya yana bayyana hayaniyar na'ura ne kawai. Nazarin haɗin gwiwa na 2020 ya auna kowane ruwan haɗi sau uku, wanda har yanzu shi ne zaɓin farawa mai kyau. Tsara jerin karatu ba tare da tsari na dindindin ba domin sauyin na'ura a hankali, manne wa gilashi, ko sauyin zafin jiki kada su bayyana kamar lanƙwasawa. Wani nazari kan cuvette na quartz ya gano cewa kusan 3 cikin ɗari na rinin daga ruwan haɗi mai 34 micromolar ya manne cikin 10 minutes, don haka ka kiyaye lokacin hulɗa, cuvette, tsaftacewa, da jeri a matsayin iri ɗaya a duk gwajin.

Misalin lissafi don bayani (ba bayanan da aka auna ba)

An ƙirƙiri lambobin da ke ƙasa ne don nuna lissafin. Ba ma'aunan dakin gwaje-gwaje ba ne kuma ba za a ambace su a matsayin bayanan methylene blue ba. Abin da yake da muhimmanci shi ne tsarin binciken da ke kewaye da su.

A ɗauka akwai samfuran ma'auni shida a cikin sinadarin daidaita pH mai matiriks iri ɗaya, da hanyar haske ta 1 cm, waɗanda aka karanta a 665 nm bisa samfurin fanko mai matiriks iri ɗaya:

Daidaita layi madaidaici da matsakaicin shanyewar haske bisa maida hankali yana ba da gangara kusa da raka'o'in shanyewar haske 0.0805 ga kowane micromolar, da mahadar layi da ginshiƙi mai nisan raka'o'in milliabsorbance kaɗan daga sifili. Raba gangarar da tsawon hanyar haske yana mayar da ita ƙimar ƙarfin shanye haske da aka gani: 0.0805 ga kowane micromolar ya yi daidai da kusan 80,500 M-1 cm-1, wanda ya dace da zangon da monoma ya fi yawa a cikin ruwa. Binciken da yake da muhimmanci ba R squared ba ne, wanda zai yi kyau sosai a kowanne hali. Muhimman abubuwan su ne mahadar layi mai kusa da sifili, rabon A610/A665 da bai sauya ba daga S2 zuwa S5, da bambance-bambancen da suka rage tsakanin ma'auni da layin lissafi waɗanda suka warwatse ba tare da wata alkibla ba. Ɗan ƙaruwar rabon a S6 alama ce ta gaskiya cewa ko dai a cire wannan matakin ko a nuna 7 micromolar a matsayin iyakar sama ta wucin gadi ga wannan haɗin matiriks da na'ura.

Samfurin da ba a san maida hankalinsa ba, wanda aka karanta a 0.245 a ƙarƙashin yanayi iri ɗaya, yana sauyawa kai tsaye: 0.245 da aka raba da 0.0805 ga kowane micromolar yana ba da kusan 3.0 micromolar, kafin a yi amfani da duk wani adadin tsarma samfurin. Bayar da sakamakon tare da yanayinsa: tsawon raƙuman haske, hanyar haske, matiriks na samfurin fanko, zangon daidaita awo, da kwanan wata.

Takardar aikin daidaita awo da za a cika

Kwafi wannan samfuri zuwa kundin dakin gwaje-gwaje ga kowane sabon matiriks. Matiriks ɗaya, takarda ɗaya, lanƙwasa ɗaya.

Jerin nau'in sinadarin gwaji yana da dalilin kasancewarsa. Methylene blue na kasuwa na iya kasancewa gishiri marar ruwan haɗi ko mai ruwan haɗi kamar trihydrate, kuma kuskuren nauyin molar yana karkatar da duk maida hankali na ƙayyadewa ba tare da an lura ba. An tattauna binciken tsarki da ƙayyadaddun halayen kayan farawa a jagorar inganci da matsayi.

Tabbatar da samfurin ma'aunin bincike mai zaman kansa

Kada lanƙwasar daidaita awo ta taɓa zama ita ce mai tantance ingancin kanta. Bayan daidaita layin lissafi, shirya samfurin ma'aunin bincike ɗaya daga ruwan tushe da aka auna nauyin sinadarinsa daban, a maida hankali kusa da tsakiyar zangon da aka karɓa, sannan a karanta shi kamar samfurin da ba a sani ba. Dacewa cikin 'yan kashi cikin ɗari yana tabbatar da jerin matakan shiryawa; rashin dacewa yana nuna matsala a ruwan tushe ko tsarmawa maimakon na'ura. Maimaita samfurin ma'aunin bincike tare da kowane rukuni na samfurori. Idan ya sauya yayin da lanƙwasar ba ta sauya ba, ka fara zargin ruwan haɗin aiki ko cuvette kafin ka zargi samfuran. Wannan ɗabi'a guda ɗaya tana gano mafi yawan kuskuren da ba sa fitowa fili: amfani da nauyin molar na sinadari mai ruwan haɗi ga kwalbar sinadari marar ruwan haɗi, micropipette da ba ta daidaita awo ba, ko sinadarin daidaita pH da aka shirya da ƙarfin ions marar dacewa. Rubuta ƙimar dawo da ma'aunin bincike a takardar aiki kusa da gangara, domin mai karantawa daga baya ya ga cewa an gwada layin, ba zana shi kawai aka yi ba.

Fahimtar rashin layi madaidaici a matsayin hanyar gano matsala

Idan lanƙwasar ta lanƙwashe, siffar gazawar tana nuna sanadin. Lanƙwasawa zuwa ƙasa a babban shanyewar haske tare da siffar bakan da ba ta sauya ba tana nuna na'ura, sau da yawa hasken da ya kauce hanya yana sa auna babban shanyewar haske ya fito ƙasa da gaskiya. Lanƙwasawa tare da ƙaruwa a kafaɗar 610 nm tana nuna yanayin sinadaran: daima da manyan tarin ƙwayoyi suna shanye haske dabam da monoma. Samfurin fanko da ba zai kai sifili ba, ko samfuran ma'aunin da ƙimarsu take raguwa da lokaci, suna nuna akwati: manne wa gilashi ko cuvettes, musamman idan lokutan hulɗa sun bambanta a cikin jerin gwajin. Kuma layi mai kyau da ya bi ta makin ma'auni amma har yanzu yake ba da sakamakon samfurori marar dacewa yana nuna matiriks: samfuran sun bambanta da samfuran daidaita awo, don haka a sake gina lanƙwasar a cikin matiriks na samfurin ko a koma ƙara ma'auni cikin samfurin. Zana bambance-bambancen da suka rage bisa maida hankali a kowane hali. Warwatsewa ba tare da tsari ba tana goyon bayan samfurin lissafin layi madaidaici; siffar murmushi ko ɓacin rai tana ƙaryata shi fiye da kowace iyakar R squared, wani batu da jagorar tabbatar da inganci ta amince da shi a fili.

Methylene blue yana saka wa wannan tsari mai tsauri. Yankin bakan monomarsa yana da ƙarfi, an fahimci yanayin sinadaransa sosai, kuma alamomin gazawarsa suna bayyana a bakan kafin su gurɓata lambobin. Gina lanƙwasar cikin ƙaramin zango, yi amfani da samfurin fanko yadda ya dace, yi maimaitattun gwaje-gwaje daga shirye-shirye masu zaman kansu, kuma bari siffar bakunan ta jagoranci zaɓin zangon. Layin da za a samu gajere ne, amma kowane maki a kansa sahihi ne.

Lissafin misalai a wannan labarin yana amfani da lambobin da aka ƙirƙira don nuna hanya. Ƙimomin coefficients na tushen bayanai da aka auna tare da cikakken yanayinsu suna cikin tushen bayanin bakan da aka haɗa, kuma an jera nazarin haɗuwar ƙwayoyi da aka dogara da shi a PMID 33251415.