માઇક્રોસ્કોપી માટે મેથિલીન બ્લૂના વિકલ્પો: કાર્ય મુજબ પસંદ કરો

સરળ બેક્ટેરિયલ સ્મિયર માટે, જો હેતુ કોષનો આકાર જોવાનો હોય તો ક્રિસ્ટલ વાયોલેટ મેથિલીન બ્લૂને બદલી શકે છે. જીવંત કોષો માટે, વધુ યોગ્ય વિકલ્પ કોઈ સ્ટેન વિના ફેઝ કોન્ટ્રાસ્ટ હોઈ શકે છે. પસંદગી તમને કયું અવલોકન કરવું છે તેના પર આધારિત છે.

માનો કે બે લોકો એક જ બેક્ટેરિયલ કલ્ચરનું પરીક્ષણ કરી રહ્યા છે. એક વ્યક્તિ દંડાકાર કોષોને ગોળ કોષોથી અલગ ઓળખવા માંગે છે. બીજી વ્યક્તિ જાણવું માંગે છે કે કોઈ સારવારથી બેક્ટેરિયા મૃત્યુ પામ્યા છે કે નહીં. પ્રથમ વ્યક્તિને સ્પષ્ટ છબી આપતું સ્ટેન બીજી વ્યક્તિને ઉપયોગી જવાબ ન પણ આપે.

વિકલ્પ પસંદ કરતા પહેલાં આ વાક્ય પૂર્ણ કરો: “મારે ___ માં ___નું અવલોકન કરવું છે, અને કોષો જીવંત રહેવા જોઈએ / જીવંત રહેવાની જરૂર નથી.” આ વાક્ય સ્ટેનને કરવાનું કાર્ય નિર્ધારિત કરે છે.

નમૂના અને પ્રશ્નથી શરૂઆત કરો

સૌ પ્રથમ નક્કી કરો કે કોષો જીવંત રહેવા જોઈએ કે નહીં, પછી કઈ વિશેષતા જોવી છે તે ઓળખો:

• કોષો જીવંત રહેવા જોઈએ: ગતિ અથવા આકાર માટે, સ્ટેન વગરનું ફેઝ કોન્ટ્રાસ્ટ અથવા DIC વિચારો; ન્યુક્લિયર DNA માટે, ફ્લોરેસન્સ સાથે Hoechst 33342 વિચારો; મેમ્બ્રેનની અખંડિતતા માટે, SYTO 9 સાથે પ્રોપિડિયમ આયોડાઇડ જેવી માન્ય કરાયેલી એસે પસંદ કરો.
• કોષો જીવંત રહેવાની જરૂર નથી: બેક્ટેરિયલ મોર્ફોલોજી માટે, ક્રિસ્ટલ-વાયોલેટ સિમ્પલ સ્ટેન અથવા નિગ્રોસિન નેગેટિવ સ્ટેન વિચારો; Gram પ્રતિક્રિયા માટે, સંપૂર્ણ Gram-stain પદ્ધતિ વાપરો; સ્થિર કરેલા કોષોમાં ન્યુક્લિયર DNA માટે, DAPI ફ્લોરેસન્સ વિચારો. દરેક શાખાની મર્યાદાઓની તુલના કરવા માટે આ કોષ્ટક વાપરો. આ પદ્ધતિઓની પસંદગીઓ છે, હાલના પ્રોટોકોલમાં માત્ર બોટલો બદલી દેવાની સૂચનાઓ નથી.

સરળ સ્મિયર માટે, પદ્ધતિ સાવધાનીથી બદલો

જ્યારે કાર્ય બેક્ટેરિયલ મોર્ફોલોજીને એક જ રંગમાં જોવાનું હોય ત્યારે ક્રિસ્ટલ વાયોલેટ વ્યવહારુ વિકલ્પ છે. FDAનું Bacteriological Analytical Manual સિમ્પલ સ્ટેનિંગ માટે યોગ્ય બે ક્રિસ્ટલ-વાયોલેટ ફોર્મ્યુલેશન સૂચવે છે. દસ્તાવેજીકૃત ફોર્મ્યુલેશન અને તેની તૈયારી પદ્ધતિ વાપરો; માત્ર ડાયનું નામ કાર્યરત રીએજન્ટને વ્યાખ્યાયિત કરતું નથી.

ક્રિસ્ટલ વાયોલેટ Gram સ્ટેનિંગમાં પણ આવે છે, પરંતુ તેથી ક્રિસ્ટલ-વાયોલેટ સિમ્પલ સ્ટેન Gram સ્ટેન બની જતું નથી. ASM Gram-stain પ્રોટોકોલમાં ભેદકારી પરિણામ ક્રિસ્ટલ વાયોલેટ, આયોડિન, ડીકલરાઇઝેશન અને કાઉન્ટરસ્ટેનિંગના ક્રમબદ્ધ કાર્ય પર આધારિત છે. આ પગલાં છોડવાથી છબી કઈ બાબત સ્થાપિત કરી શકે છે તે બદલાય છે. આ તફાવત માટે સિમ્પલ સ્ટેનિંગ અને Gram સ્ટેનિંગની તુલના જુઓ.

નિગ્રોસિન રૂપરેખા દર્શાવવાની અલગ રીત આપે છે: તે પૃષ્ઠભૂમિને ગાઢ બનાવે છે જ્યારે બેક્ટેરિયલ કોષો તુલનાત્મક રીતે હળવા દેખાય છે. Merckની નિગ્રોસિન સૂચનાઓમાં એક ઉપયોગી વિગત છે જે સામાન્ય વિકલ્પોની યાદીમાં રહી જઈ શકે છે. તેના નિર્દિષ્ટ કાર્યરત ફોર્મ્યુલેશનમાં ફોર્માલ્ડિહાઇડ સામેલ છે. તેથી કોષો પોતે સ્ટેન વગરના દેખાતા હોવા છતાં, માત્ર “નેગેટિવ સ્ટેન” શબ્દોથી જીવંત કોષો સાથે સુસંગતતા અનુમાન કરી શકાતી નથી. સંપૂર્ણ ફોર્મ્યુલેશન અને નમૂના તૈયારી તપાસો.

જીવંત નમૂનાઓ માટે, ઑપ્ટિક્સ બદલવાનું વિચારો

જો તમે કોષોને હલતા અથવા વિભાજિત થતા જોવું માંગો છો, તો બીજો ડાય ઉમેરવાથી અવલોકન વધુ જટિલ બની શકે છે. Nikon તેના પારદર્શક નમૂનાઓમાં કોન્ટ્રાસ્ટ માર્ગદર્શનમાં સમજાવે છે તેમ, ફેઝ કોન્ટ્રાસ્ટ અને differential interference contrast, અથવા DIC, નમૂનાઓના ઑપ્ટિકલ ગુણધર્મોમાં રહેલા તફાવતો દ્વારા તેમને દૃશ્યમાન બનાવે છે. માઇક્રોસ્કોપમાં જરૂરી ઘટકો હોય તો તેઓ જીવંત, સ્ટેન વગરના કોષો દર્શાવી શકે છે.

આ પસંદગી સ્ટેન વગરનું પ્રિપરેશન જાળવે છે, પરંતુ ઉપલબ્ધ માહિતી બદલે છે. કયું અણુ કોન્ટ્રાસ્ટ પેદા કરે છે તે જાણ્યા વગર તમે સીમા અથવા ગતિને અનુસરી શકો છો. જો પ્રશ્ન અણુના સ્થાનીકરણનો હોય, તો તેના બદલે યોગ્ય લેબલિંગ પદ્ધતિ પસંદ કરો.

ન્યુક્લિયર DNA માટે, Invitrogenની DAPI અને Hoechst સ્ટેન્સની તુલના DAPIના સ્થિર કરેલા કોષો સાથેના સામાન્ય ઉપયોગને વધુ cell-permeant Hoechst 33342થી અલગ પાડે છે, જેને જીવંત કોષોના લેબલિંગ માટે પસંદ કરવામાં આવે છે. બંને માટે ફ્લોરેસન્સ સાધનો જરૂરી છે. બંનેમાંથી કોઈ પણ રંગીન બ્રાઇટફિલ્ડ સ્ટેનનો સીધો વિકલ્પ નથી.

ડાયના સંપર્ક અને illuminationને પ્રયોગાત્મક પરિસ્થિતિઓ તરીકે માનો. જ્યારે કોષોનું વર્તન તમારું માપન હોય ત્યારે સ્ટેન કરેલા અને સ્ટેન વગરના પ્રિપરેશનોની તુલના કરો.

લાલ કોષ આપમેળે મૃત કોષ નથી

બેક્ટેરિયલ મેમ્બ્રેનની અખંડિતતા આંકવા માટે SYTO 9 અને પ્રોપિડિયમ આયોડાઇડ ઘણી વખત સાથે વપરાય છે. BacLight માર્ગદર્શિકા અખંડિત મેમ્બ્રેનને લીલા સ્ટેનિંગ અને નુકસાન પામેલા મેમ્બ્રેનને લાલ સ્ટેનિંગ સાથે જોડે છે. આ અર્થઘટનને નમૂના માટે માન્ય કરવું જરૂરી છે.

Rosenberg અને સહકર્મીઓ દ્વારા કરવામાં આવેલ 2019નો અભ્યાસ આ સમસ્યાનું ઉદાહરણ આપે છે. phosphate-buffered salineમાં કાચ પરના 24-hour E. coli બાયોફિલ્મ્સમાં, લગભગ 96% કોષો in situ પ્રોપિડિયમ-આયોડાઇડ-પોઝિટિવ દેખાયા. છતાં લેખકોએ અંદાજ લગાવ્યો કે harvesting પછી 82% કલ્ચર કરી શકાય તેવા હતા. Confocal છબીઓમાં લાલ સ્ટેન થયેલા પદાર્થની નીચે લીલા આંતરિક ભાગવાળા કોષો દેખાયા, જે ભ્રામક સિગ્નલમાં extracellular nucleic acidsની ભૂમિકા સૂચવે છે.

આ ટકાવારીઓ અભ્યાસના પ્રિપરેશનો પર કરાયેલા જુદા માપનો વર્ણન કરે છે, કોઈ સર્વમાન્ય સુધારક ગુણાંકનો નહીં. ઉપયોગી પાઠ એ છે કે સિગ્નલ કઈ વસ્તુએ પેદા કર્યો તે તપાસવું. બાયોફિલ્મમાં, nucleic-acid ડાય નુકસાન પામેલા કોષોની અંદરની સામગ્રી ઉપરાંત કોષોની બહારની સામગ્રી પણ શોધી શકે છે. જીવંતતા અંગેના નિષ્કર્ષ માટે, સંશોધકો cultivation અથવા metabolic activity જેવા પૂરક માપનોની ભલામણ કરે છે, સાથે એ સ્વીકારે છે કે દરેકની પોતાની મર્યાદાઓ છે.

વિકલ્પમાં વાસ્તવમાં શું છે તે તપાસો

વૈકલ્પિક સ્ટેનિંગ પદ્ધતિમાં હજુ પણ મેથિલીન બ્લૂ હોઈ શકે છે. Giemsa તેનું ઉદાહરણ છે: Merck તેના ઉત્પાદનને azure-eosin-methylene-blue solution તરીકે વર્ણવે છે, જેનો હેતુ રક્ત અને bone-marrow smears સહિતના ઉપયોગો માટે છે. તે અલગ નમૂના માટે અલગ પદ્ધતિ હોઈ શકે છે, પરંતુ મેથિલીન બ્લૂને બહાર રાખવાની જરૂરિયાત પૂરી કરતી નથી.

જો કોઈ સંયોજનને બહાર રાખવું પ્રયોગનો ભાગ હોય, તો છબીઓની તુલના કરતા પહેલાં રીએજન્ટની ઓળખ અને ફોર્મ્યુલેશન તપાસો. મેથિલ બ્લૂ, મેથિલીન બ્લૂ અને સમાન નામ ધરાવતા ડાય્સ અંગેની માર્ગદર્શિકા નામકરણના તફાવતો સમજાવે છે.

પરિણામ વાપરતા પહેલાં વિકલ્પની ચકાસણી કરો

નવી પદ્ધતિ માટે, પ્રતિનિધિત્વ કરતા નમૂનાઓ અને યોગ્ય નિયંત્રણનો ઉપયોગ કરીને નાની તુલના કરો. શક્ય હોય ત્યાં સુધી માઇક્રોસ્કોપ સેટિંગ્સ તુલનાત્મક રાખો. રીએજન્ટ ફોર્મ્યુલેશન, નમૂના તૈયારી, exposure અને ઇમેજિંગ પરિસ્થિતિઓ નોંધો, જેથી વધુ સારી દેખાતી છબી માત્ર પસંદ ન થાય પરંતુ તેની તપાસ કરી શકાય.

સફળતાનું મૂલ્યાંકન મૂળ પ્રશ્ન સામે કરો. મોર્ફોલોજી માટે, કોષોની સીમાઓ અને ગોઠવણી હજી પણ સમજાય તેવી રહે છે કે નહીં તે તપાસો. ન્યુક્લિયર લેબલિંગ માટે, સિગ્નલનું સ્થાન અને પૃષ્ઠભૂમિ તપાસો. જીવંતતા માટે, માત્ર આકર્ષક રંગ-વિભાજન કરતાં વધુ પુરાવાની જરૂર રાખો. મેથિલીન બ્લૂ સ્ટેનિંગ અને પ્રયોગશાળાના ઉપયોગો અંગેની વિસ્તૃત માર્ગદર્શિકા અવલોકન અને તૈયારી એકબીજા સાથે કેવી રીતે જોડાય છે તે સમજાવે છે.

તમને જરૂરી માપન જાળવી રાખે એવો વિકલ્પ પસંદ કરો. રંગ પરિણામરૂપ છબીનો માત્ર એક ગુણધર્મ છે.