લેખ
મિથિલીન બ્લૂ અને ફેરોપ્ટોસિસ: આયર્ન, લિપિડ પેરોક્સિડેશન અને કોષમૃત્યુ
ફેરોપ્ટોસિસ એટલે પટલને થતા નુકસાનથી કોષનું મૃત્યુ. પટલમાં રહેલી બહુઅસંતૃપ્ત ચરબીનું શૃંખલા પ્રતિક્રિયામાં ઓક્સિડેશન થાય છે, પટલ કાર્ય ગુમાવે છે અને કોષ મરી જાય છે. આ રાસાયણિક પ્રક્રિયા માટે આયર્ન જરૂરી છે. આ વાક્યમાં જ સમગ્ર ખ્યાલ સમાયેલો છે, અને આ લેખમાંનું બધું તેના કોઈ એક ભાગની કસોટી છે.
અહીંનો પ્રશ્ન વધુ સીમિત છે: કોષો પરના પ્રયોગોમાં મિથિલીન બ્લૂ આ શૃંખલા પર શું અસર કરે છે, અને એ પરિણામ ખરેખર શું દર્શાવે છે. ટૂંકો જવાબ એ છે કે પ્રયોગશાળાના બે અભ્યાસોમાં, nanomolar સ્તરે મિથિલીન બ્લૂએ માઇટોકોન્ડ્રિયાના લિપિડ પેરોક્સિડેશનને ઘટાડ્યું અને સામાન્ય રીતે ફેરોપ્ટોસિસ સર્જતાં પ્રેરક પરિબળો લાગુ કર્યા પછી પણ કોષોને જીવંત રાખ્યા. વિગતવાર જવાબ વધુ મહત્ત્વનો છે, કારણ કે શૃંખલાની દરેક કડીને અલગ હસ્તક્ષેપથી ચકાસવામાં આવી હતી, અને દરેક હસ્તક્ષેપની મર્યાદાઓ છે.
એક ફકરામાં ફેરોપ્ટોસિસ
બહુઅસંતૃપ્ત ફેટી એસિડની પૂંછડી ધરાવતા પટલના ફોસ્ફોલિપિડમાં એક નબળું સ્થાન હોય છે: એવા હાઇડ્રોજન પરમાણુઓ જેને સહેલાઈથી છીનવી શકાય. એકવાર કોઈ રેડિકલ આવો એક પરમાણુ છીનવી લે, પછી લિપિડ સાથે ઓક્સિજન જોડાય છે, લિપિડ પેરોક્સિલ રેડિકલ બને છે અને એ રેડિકલ આગળના લિપિડમાંથી હાઇડ્રોજન છીનવે છે. કોઈ વસ્તુ તેને અટકાવે નહીં ત્યાં સુધી આ પ્રતિક્રિયા પટલમાં આગળ વધતી રહે છે.
મુખ્ય અવરોધક GPX4 નામનું એન્ઝાઇમ છે, જે ગ્લુટાથાયોનનો ઉપયોગ કરીને લિપિડ પેરોક્સાઇડનું અપચય કરી તેમને હાનિરહિત લિપિડ આલ્કોહોલમાં ફેરવે છે. પ્રયોગશાળામાં વપરાતા પ્રેરકો આ રક્ષણ પર ચોક્કસ બિંદુઓએ હુમલો કરે છે. એરાસ્ટિન સિસ્ટમ xc-minus દ્વારા થતા સિસ્ટિનના પ્રવેશને અવરોધે છે, જેથી કોષને ગ્લુટાથાયોનના સંશ્લેષણ માટે સિસ્ટીનની અછત પડે છે. બ્યુથિયોનિન સલ્ફોક્સિમાઇન સીધું ગ્લુટાથાયોનનું સંશ્લેષણ અવરોધે છે. RSL3 પોતે GPX4ને અવરોધે છે. આ ત્રણેયના કારણે પેરોક્સાઇડ દૂર થતા નથી, પરંતુ તેઓ અલગ-અલગ તબક્કે આ અસર કરે છે, તેથી એક પ્રેરક સાથે મળેલું પરિણામ આપોઆપ બીજા પ્રેરકોને લાગુ પડતું નથી.
ફેરોપ્ટોસિસને વ્યાખ્યાયિત કરતાં લક્ષણો તેને એપોપ્ટોસિસથી અલગ પાડે છે. તેમાં કૅસ્પેઝની ક્રમિક શૃંખલા નથી અને એપોપ્ટોટિક બોડીઝ પણ બનતાં નથી. ડેફેરોક્સામાઇન જેવા આયર્ન ચીલેટર્સ અને ફેરોસ્ટેટિન-1 જેવા રેડિકલને પકડી રાખતા પદાર્થો તેને દબાવે છે. કોષમૃત્યુ માત્ર નેક્રોટિક નથી, પરંતુ ફેરોપ્ટોટિક છે એવું નક્કી કરવા સંશોધકો આ પ્રાયોગિક કસોટી વાપરે છે. નિયંત્રિત કોષમૃત્યુના વિવિધ માર્ગોનો વ્યાપક પરિપ્રેક્ષ્ય આ ભેદને સમજવામાં મદદ કરે છે, અને કોષો સહેલાઈથી પ્રતિક્રિયા કરી શકતા આયર્નને કેવી રીતે સંભાળે છે તે સમજાવે છે કે ચીલેશન આટલું નિર્ણાયક નિયંત્રણ કેમ છે.
માઇટોકોન્ડ્રિયાની ભૂમિકા ક્યાં છે, અને તેના વિશે વિવાદ કેમ હતો
શરૂઆતના સંશોધનમાં જણાવાયું હતું કે માઇટોકોન્ડ્રિયલ DNA વગરના કોષોમાં પણ ફેરોપ્ટોસિસ થાય છે, જે સૂચવતું હતું કે માઇટોકોન્ડ્રિયા અનિવાર્ય નથી. પછીના સંશોધનમાં જાણવા મળ્યું કે માઇટોકોન્ડ્રિયાની સંખ્યા ઘટાડવાથી અથવા કોષીય શ્વસન અવરોધવાથી સિસ્ટીનની અછતથી થતો ફેરોપ્ટોસિસ દબાઈ શકે છે, પરંતુ GPX4ના સીધા અવરોધથી થતો ફેરોપ્ટોસિસ નહીં. જો માઇટોકોન્ડ્રિયાનું યોગદાન પ્રેરક, કોષના પ્રકાર અને નિર્ણાયક પેરોક્સિડેશન ક્યાં થાય છે તેના પર આધારિત હોય, તો બંને પરિણામો સાચાં હોઈ શકે.
આ લેખના આધારરૂપ અભ્યાસે આ વિવાદને કોષના ચોક્કસ વિભાગ માટેની પ્રોબ વડે તપાસ્યો. MitoCLox લિપિડ પેરોક્સિડેશન દર્શાવતા સૂચકનું માઇટોકોન્ડ્રિયા-લક્ષિત સ્વરૂપ છે: માઇટોકોન્ડ્રિયાની અંદર લિપિડ પેરોક્સિલ રેડિકલના સંપર્કમાં આવતાં તેની ફ્લોરેસન્સ બદલાય છે. એરાસ્ટિનથી ઉપચારિત ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટમાં, મૃત્યુ પહેલાં હજી જીવંત કોષોમાં માઇટોકોન્ડ્રિયલ પ્રોબનું ઓક્સિડેશન દેખાયું, અને કોષસમૂહમાં તેનું પ્રમાણ અસમાન હતું. આ સમયક્રમ મહત્ત્વનો છે. મૃત્યુ પહેલાં થતું પેરોક્સિડેશન સંભવિત કારણ હોઈ શકે છે. માત્ર મૃત કોષોમાં માપેલું પેરોક્સિડેશન તો અવશેષ છે. લિપિડ પેરોક્સિડેશનની પરીક્ષણ પદ્ધતિઓ અને દરેક પ્રોબ શું દર્શાવે છે અંગેની પૂરક માર્ગદર્શિકા સમજાવે છે કે પ્રોબનું સ્થાન સંકેતનો અર્થ કેમ નક્કી કરે છે.
બીજા મોડેલમાં પણ આવી જ ભાત જોવા મળી. લેબર હેરેડિટરી ઑપ્ટિક ન્યુરોપથી ધરાવતા દર્દીના ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટમાં કોમ્પ્લેક્સ Iનું મ્યુટેશન અને શરૂઆતથી જ વધુ ઓક્સિડેટિવ તાણ હતું. ગ્લુટાથાયોન ઘટાડી દેવાતાં આ કોષો ફેરોપ્ટોસિસથી મૃત્યુ પામ્યા, જ્યારે નિયંત્રણ ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટે તેનો પ્રતિકાર કર્યો. અહીં પણ માઇટોકોન્ડ્રિયલ પ્રોબનું ઓક્સિડેશન પહેલાં થયું. વિગતો ફેરોપ્ટોસિસમાં માઇટોકોન્ડ્રિયલ લિપિડ પેરોક્સિડેશનના ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટ અભ્યાસમાં છે.
આ પ્રયોગોમાં મિથિલીન બ્લૂએ શું બદલ્યું
મિથિલીન બ્લૂ રેડોક્સ વાહક છે. તેનું ઓક્સિડાઇઝ્ડ સ્વરૂપ કોમ્પ્લેક્સ I પર NADH સાથે સંકળાયેલી રાસાયણિક પ્રક્રિયામાંથી ઇલેક્ટ્રોન સ્વીકારે છે, અને તેનું અપચયિત સ્વરૂપ તેમને સાઇટોક્રોમ cને આપે છે, જે કોમ્પ્લેક્સ IVને ઇલેક્ટ્રોન પૂરા પાડે છે. આથી શૃંખલાના એ ભાગને આંશિક રીતે બાજુએ રાખતો માર્ગ બને છે, જ્યાં સામાન્ય રીતે ઇલેક્ટ્રોન ઓક્સિજન તરફ લીક થઈ સુપરઓક્સાઇડ બનાવે છે. ઇલેક્ટ્રોનના આ હસ્તાંતરણનું સંપૂર્ણ ચિત્ર સમજવા માગતા વાચકોએ મિથિલીન બ્લૂ માઇટોકોન્ડ્રિયામાં ઇલેક્ટ્રોન કેવી રીતે વહન કરે છેથી શરૂઆત કરવી જોઈએ.
એરાસ્ટિનથી ઉપચારિત ફેફસાના ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટમાં, 250 nanomolar મિથિલીન બ્લૂએ માઇટોકોન્ડ્રિયા-લક્ષિત એન્ટીઑક્સિડન્ટ્સ SkQ1 અને MitoTEMPOની જેમ જ કોષોના અસ્તિત્વનું માપન કરતી કસોટીમાં કોષોની જીવંતતા જાળવી રાખી. નિયંત્રણો આ દાવાની સીમા નક્કી કરે છે. ફેરોસ્ટેટિન-1, આલ્ફા-ટોકોફેરોલ અને ડેફેરોક્સામાઇનએ પણ રક્ષણ આપ્યું, જે મૃત્યુ ફેરોપ્ટોટિક હતું તેની પુષ્ટિ કરે છે. એન્ટીઑક્સિડન્ટ જૂથ વગરના SkQ1ના સમાન સંયોજને રક્ષણ આપ્યું નહીં, જે બિનવિશિષ્ટ સંચયને બદલે રેડોક્સ રસાયણશાસ્ત્ર તરફ સંકેત કરે છે. લગભગ 200 nanomolarથી વધુ SkQ1 પર રક્ષણ ઘટતું ગયું, જે વધુ પ્રમાણમાં ક્વિનોન એન્ટીઑક્સિડન્ટ્સના જાણીતા પ્રો-ઓક્સિડન્ટ વર્તન સાથે સુસંગત છે. મિથિલીન બ્લૂનું પણ માત્રા પ્રમાણે આવું બેવડું વર્તન છે: આ કલ્ચર ડિશોમાં ઓછા nanomolar સ્તરે તે રક્ષણ આપે છે, પરંતુ વધુ પ્રમાણમાં અથવા તીવ્ર પ્રકાશ હેઠળ રેડોક્સ સાઇક્લિંગ દ્વારા હાઇડ્રોજન પેરોક્સાઇડ બનાવી શકે છે. માત્રાનો આ પ્રકારનો સંદર્ભ માઇટોકોન્ડ્રિયામાં પ્રતિક્રિયાશીલ ઓક્સિજન પ્રજાતિઓમાં સમજાવવામાં આવ્યો છે.
ત્યારબાદ અલગ કરેલા માઇટોકોન્ડ્રિયા પરના પ્રયોગોએ ROSના સ્રોતોને અલગ પાડ્યા. ફેરસ આયર્નની હાજરીમાં, કોમ્પ્લેક્સ Iને ઇલેક્ટ્રોન પૂરા પાડતા સબસ્ટ્રેટ્સ સાથે રોટેનોન ઉમેરવાથી પ્રોબનું ઓક્સિડેશન વધ્યું. રોટેનોન ફ્લેવિન સ્થાન પછીના તબક્કે અવરોધે છે, તેથી તે પહેલાંના વાહકો અપચયિત સ્થિતિમાં રહે છે અને મેટ્રિક્સ તરફ મુખ ધરાવતા ફ્લેવિનમાંથી ઇલેક્ટ્રોન ઓક્સિજન તરફ લીક થાય છે. કોમ્પ્લેક્સ IIIને ઇલેક્ટ્રોન પૂરા પાડતા સબસ્ટ્રેટ્સ સાથે એન્ટિમાઇસિન Aએ પુષ્કળ હાઇડ્રોજન પેરોક્સાઇડ ઉત્પન્ન કર્યું, છતાં લિપિડ પેરોક્સિડેશનને આગળ ધપાવ્યું નહીં. એકંદર ROSનો સંકેત સરખો, પરંતુ સ્થાન અલગ અને પરિણામ પણ અલગ. SkQ1 અને મિથિલીન બ્લૂ બંનેએ હાઇડ્રોજન પેરોક્સાઇડનું ઉત્પાદન દબાવ્યા વગર કોમ્પ્લેક્સ I દ્વારા પ્રેરિત પેરોક્સિડેશનને દબાવ્યું. આ તેમની ક્રિયાને ROS બન્યા પછીના લિપિડ પેરોક્સિડેશનના તબક્કે મૂકે છે.
આયર્નના અતિભારવાળો ભાગ અને લિપોફ્યુસિનનો સંકેત
બીજા અભ્યાસે આ પ્રશ્નને આયર્નની બાજુથી તપાસ્યો. submillimolar ફેરિક એમોનિયમ સાઇટ્રેટના સંપર્કમાં આવેલા H9c2 કાર્ડિયોમાયોસાઇટ્સમાં માઇટોકોન્ડ્રિયલ ROS, માઇટોકોન્ડ્રિયલ લિપિડ પેરોક્સિડેશન અને પછી ફેરોપ્ટોસિસ થયો, ત્યારબાદ 24 hoursની અંદર લિપોફ્યુસિન જેવા રંજકનો સંચય થયો. લિપોફ્યુસિન ઓક્સિડાઇઝ્ડ લિપિડ અને પ્રોટીનનો આયર્ન ધરાવતો, સ્વયં ફ્લોરેસન્સ આપતો અવશેષ છે, જે ઉંમર સાથે એકઠો થાય છે. અહીં તેનું ઝડપથી દેખાવું આયર્નથી પ્રેરિત તીવ્ર પેરોક્સિડેશનને વૃદ્ધત્વના એક જાણીતા સૂચક સાથે જોડે છે. nanomolar સ્તરે મિથિલીન બ્લૂ અને SkQ1 બંનેએ પેરોક્સિડેશન, મૃત્યુ અને રંજકનો સંચય અટકાવ્યો. હૃદયમાંથી અલગ કરેલા માઇટોકોન્ડ્રિયાએ આ જ ભાતની પુષ્ટિ કરી: રોટેનોન સાથે ફેરસ આયર્નએ પેરોક્સિડેશન અને રંજક જેવા સંકેતને પ્રેર્યા, અને બંને પદાર્થોએ તેને અવરોધ્યા. સંપૂર્ણ ક્રમ H9c2 કાર્ડિયોમાયોસાઇટ્સમાં આયર્નના અતિભારના અભ્યાસમાં જણાવવામાં આવ્યો છે. આ વિષયનું રંજક-સંબંધિત પાસું લિપોફ્યુસિન અને કોષીય વૃદ્ધત્વના સૂચકો સાથે જોડાય છે.
કોષોના અસ્તિત્વની કસોટીઓ શું દર્શાવતી નથી
CellTiterBlue જેવી જીવંતતા માપતી કસોટી દર્શાવે છે કે પ્રેરક અને સંભવિત રક્ષક પદાર્થ લાગુ કર્યા પછી ડિશમાં કેટલા કોષો ચયાપચયની દૃષ્ટિએ સક્રિય રહે છે. આ નિર્ધારિત પ્રણાલીમાં એક કાર્યપદ્ધતિની કસોટી છે. તે સારવારનું પરિણામ નથી. આમાંથી કોઈ પ્રયોગમાં દર્દીને માત્રા આપવામાં આવી નહોતી, રોગના પરિણામનું માપન કરવામાં આવ્યું નહોતું કે શરીરમાં ઉપચાર માટેની સલામત અને અસરકારક માત્રાની મર્યાદા સ્થાપિત કરવામાં આવી નહોતી.
ચાર મર્યાદાઓ સ્પષ્ટપણે જણાવવી જરૂરી છે. પ્રથમ, કોષોના પ્રકારો સીમિત છે: રૂપાંતરિત ફેફસાના ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટ, માઇટોકોન્ડ્રિયલ રોગ ધરાવતી એક કોષલાઇન સહિત ત્વચાના પ્રાથમિક ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટ, ઉંદરના કાર્ડિયોમાયોસાઇટની એક કોષલાઇન અને ઉંદરના હૃદયમાંથી અલગ કરેલા માઇટોકોન્ડ્રિયા. કોષલાઇન પ્રમાણે સંવેદનશીલતા બદલાતી હતી, અને LHON કોષલાઇનને તેની અસામાન્ય સંવેદનશીલતા માટે જ પસંદ કરવામાં આવી હતી. બીજું, પ્રેરકો પ્રયોગશાળાની આત્યંતિક પરિસ્થિતિઓ છે: પરિવહન અથવા સંશ્લેષણનો સંપૂર્ણ અવરોધ, અને આયર્નનું એવું પ્રમાણ જેનો કોઈ પેશીને અચાનક સામનો કરવો પડે નહીં. ત્રીજું, સાંદ્રતાને ગુણાકાર કરીને સીધી માત્રામાં રૂપાંતરિત કરી શકાતી નથી. કલ્ચર માધ્યમમાં nanomolar સાંદ્રતા એ માનવ માટેની માત્રા નથી. ડિશના પરિણામને વ્યક્તિ પર લાગુ કરવા વચ્ચે મિથિલીન બ્લૂનું વિતરણ, લોહી અને પેશીમાં તેનું રંગહીન સ્વરૂપમાં અપચય, પ્રકાશનો સંપર્ક અને પટલનો વિદ્યુતવિભવ જેવા પરિબળો આવે છે. ચોથું, પ્રોબ પોતાના જ કોષીય વિભાગની માહિતી આપે છે. MitoCLoxનું ઓક્સિડેશન દર્શાવે છે કે માઇટોકોન્ડ્રિયામાં લિપિડ રેડિકલ બન્યા હતા; તે એવું દર્શાવતું નથી કે સંભવિત અંતિમ ઘટના ગણાતું પ્લાઝ્મા પટલનું ફાટવું, અગાઉના તબક્કે ટાળવાને બદલે સીધું જ અટકાવવામાં આવ્યું હતું.
તેથી પ્રામાણિક દાવો આટલો જ છે: આ મોડેલોમાં, કોમ્પ્લેક્સ Iમાંથી ઉત્પન્ન થતા ROS અને આયર્ન સાથે મળીને માઇટોકોન્ડ્રિયલ લિપિડ પેરોક્સિડેશનને પ્રેરે છે, જે ફેરોપ્ટોસિસ પહેલાં થાય છે, અને ઓછી સાંદ્રતાએ મિથિલીન બ્લૂ આ તબક્કાને અટકાવે છે. આ તબક્કાથી આગળના કોઈપણ દાવા માટે પહેલાં પ્રાણીઓમાં અને પછી લોકોમાં અલગ પ્રયોગોની જરૂર છે.