શું મિથિલીન બ્લૂ માઇટોકોન્ડ્રિયલ Complex III ને બાયપાસ કરી શકે છે? અભ્યાસો શા માટે અસહમત છે

બે પ્રયોગશાળાઓએ તપાસ્યું કે મિથિલીન બ્લૂ અવરોધાયેલા માઇટોકોન્ડ્રિયલ Complex III ને બાયપાસ કરી શકે છે કે નહીં. એકનો જવાબ ના હતો. બીજીનો જવાબ હા હતો. બંને પાસે ડેટા હતો.

માઉસના મગજના માઇટોકોન્ડ્રિયા પરના પ્રથમ અભ્યાસમાં જાણવા મળ્યું કે આ રંજક બાયપાસ કરી શકતો નથી. ઉંદરવર્ગની ત્રણ પ્રજાતિઓના મગજના માઇટોકોન્ડ્રિયા પરના બીજા અભ્યાસમાં જાણવા મળ્યું કે તે આંશિક રીતે કરી શકે છે. માઉસના યકૃત પરનો ત્રીજો અભ્યાસ ઘણી વાર આ સંદર્ભમાં ટાંકવામાં આવે છે, પરંતુ તેણે કંઈક અલગ તપાસ્યું હતું. તેને તેના યોગ્ય સંદર્ભમાં રાખવાથી અડધી મૂંઝવણ દૂર થાય છે.

અહીં કોઈ સાર્વત્રિક કાર્યપદ્ધતિ જાહેર કરી શકાય તેમ નથી. અહીં અલગ અવરોધકો, માત્રાઓ અને માપનો ધરાવતા ત્રણ પ્રયોગો છે. પહેલાં પરિસ્થિતિઓ વાંચો. પછી નિષ્કર્ષો સમજાશે.

અહીં બાયપાસનો અર્થ શું છે

ઇલેક્ટ્રોન Complex I દ્વારા (NADH માંથી) અથવા Complex II દ્વારા (સક્સિનેટમાંથી) શૃંખલામાં પ્રવેશે છે, Complex III માંથી પસાર થઈને સાયટોક્રોમ c સુધી પહોંચે છે, પછી Complex IV દ્વારા ઓક્સિજન સુધી જાય છે. આ માર્ગમાં બનતા ગ્રેડિયન્ટનો ઉપયોગ કોષ ATP બનાવવા માટે કરે છે.

બાયપાસનો દાવો એવો છે કે મિથિલીન બ્લૂ અવરોધ પહેલાંના ભાગમાંથી ઇલેક્ટ્રોન લે છે અને અવરોધ પછીના ભાગમાં પહોંચાડે છે. ઓક્સિડાઇઝ થયેલો રંજક NADH અથવા શૃંખલાના શરૂઆતના ઘટકોમાંથી ઇલેક્ટ્રોન લઈને લ્યુકોમિથિલીન બ્લૂ બને છે, અને તેનું રિડ્યુસ થયેલું સ્વરૂપ તે ઇલેક્ટ્રોન સાયટોક્રોમ c ને અથવા પાછા શૃંખલામાં આપે છે. જો આ હસ્તાંતરણ અવરોધ પછી થાય, તો શ્વસન અને મેમ્બ્રેન પોટેન્શિયલ આંશિક રીતે પુનઃસ્થાપિત થાય છે. જો તે અવરોધના સ્થળે અથવા તેની પહેલાં થાય, તો કશું પુનઃસ્થાપિત થતું નથી.

Complex III ની એક વિગત આ વિવાદનો મોટો ભાગ નક્કી કરે છે. આ કોમ્પ્લેક્સ બે અવરોધક સ્થળો ધરાવતું Q ચક્ર ચલાવે છે. એન્ટિમાઇસિન Qi સ્થળે જોડાય છે. માઇક્સોથાયાઝોલ Qo સ્થળે જોડાય છે. આમાંથી માત્ર એકનો ઉપયોગ કરતો અભ્યાસ કોમ્પ્લેક્સના માત્ર અડધા ભાગનું પરીક્ષણ કરે છે.

પ્રથમ અભ્યાસ: માઉસના મગજના માઇટોકોન્ડ્રિયામાં બાયપાસ નહીં

Gureev અને સહકર્મીઓએ C57BL/6 માઉસના મગજના કોર્ટેક્સમાંથી ડિજિટોનિન વડે અલગ કરેલા માઇટોકોન્ડ્રિયાનો ઉપયોગ કર્યો અને પ્રતિ ml 0.1 mg પ્રોટીન પર પરીક્ષણ કર્યું. સબસ્ટ્રેટની ત્રણ પરિસ્થિતિઓ હતી: પાયરુવેટ સાથે મેલેટ, બંને 5 mM પર; 10 mM સક્સિનેટ સાથે 2 mM ગ્લુટામેટ; અને 10 mM L-પ્રોલિન. અવરોધકોમાં 1 micromolar રોટેનોન (Complex I) અને પ્રતિ ml 1 microgram એન્ટિમાઇસિન (Complex III) હતા. રંજકની માત્રાઓ 0.5, 1 અને 2 micromolar હતી, જેમાં મુખ્ય સાંદ્રતા 1 micromolar હતી. પદ્ધતિઓ અને માપન-ટ્રેસ FEBS Letters ના સંક્ષિપ્ત સંશોધન લેખમાં છે.

Complex I નો બાયપાસ થયો. રોટેનોને ADP દ્વારા ઉત્તેજિત શ્વસનને પ્રતિ મિનિટ પ્રતિ mg લગભગ 121 nmol થી ઘટાડીને લગભગ 2 કર્યું, અને 1 micromolar રંજકે તેને ફરી લગભગ 21 સુધી વધાર્યું. પાયરુવેટ સાથે મેલેટ અને L-પ્રોલિન પર મેમ્બ્રેન પોટેન્શિયલ પુનઃસ્થાપિત થયું.

Complex III નો બાયપાસ થયો નહીં. એન્ટિમાઇસિને શ્વસનને ઘટાડીને લગભગ 16 કર્યું, અને રંજકે તેને માત્ર લગભગ 20 સુધી વધાર્યું. રંજકની 5 micromolar સુધીની માત્રાઓ પર પણ કોઈ સબસ્ટ્રેટ સાથે મેમ્બ્રેન પોટેન્શિયલ પુનઃસ્થાપિત થયું નહીં. પેરોક્સાઇડના ડેટાએ પણ એ જ દિશા બતાવી: એકલા રંજકે પેરોક્સાઇડનું ઉત્સર્જન પ્રતિ મિનિટ પ્રતિ mg લગભગ 76 pmol ના મૂળભૂત દરથી વધારીને ત્રણ માત્રાઓ પર આશરે 1170, 1460 અને 1945 કર્યું, છતાં એન્ટિમાઇસિને રંજકથી ઉત્પન્ન થયેલા આ સંકેતને અનુક્રમે લગભગ 25, 88 અને 96 ટકા ઘટાડ્યો. જો રિડ્યુસ થયેલો રંજક સીધો ઓક્સિજન સાથે પ્રતિક્રિયા કરતો હોય, તો Complex III ને અવરોધવાથી આ સંકેત દબાવવો ન જોઈએ. લેખકોએ અનુમાન કર્યું કે રિડ્યુસ થયેલો રંજક એન્ટિમાઇસિનના અવરોધ પહેલાં, Complex III ના Qo સ્થળે ઓક્સિડાઇઝ થાય છે. શબ્દોમાં આ ટૂંકું ચક્ર: દાતાઓથી રંજક સુધી, રંજકથી Qo સુધી, અને આગળ સામાન્ય માર્ગે. રોટેનોનનો બાયપાસ થાય છે. એન્ટિમાઇસિનનો થતો નથી.

બીજો અભ્યાસ: ત્રણ પ્રજાતિઓમાં, બંને અવરોધક સ્થળો પર આંશિક બાયપાસ

Svab અને સહકર્મીઓએ પ્રયોગની રચના વિસ્તારી. માઉસ, રેટ અને ગિની પિગના મગજમાંથી Percoll વડે અલગ કરેલા માઇટોકોન્ડ્રિયાનું એ જ પ્રતિ ml 0.1 mg પર પરીક્ષણ કર્યું, જેમાં પાયરુવેટ સાથે મેલેટ અથવા ગ્લુટામેટ સાથે મેલેટ, દરેક 5 mM પર હતા. તેમણે Complex III ના બે અવરોધકો વાપર્યા: 0.3 micromolar એન્ટિમાઇસિન A અને 1 micromolar માઇક્સોથાયાઝોલ. મોટાભાગનાં પરીક્ષણોમાં રંજક 2 micromolar હતો અને સાયટોક્રોમ c સંબંધિત પરીક્ષણોમાં 0.5 હતો. સમાન પ્રોટોકોલ સાથેની ત્રણેય પ્રજાતિઓના પરિણામો મુક્ત રીતે ઉપલબ્ધ સંશોધન લેખમાં છે.

ત્રણેય પ્રજાતિઓમાં બંને અવરોધોનો આંશિક બાયપાસ થયો. માઉસના માઇટોકોન્ડ્રિયામાં એન્ટિમાઇસિને શ્વસન દબાવ્યું અને રંજકે તેને લગભગ 60 ટકા વધાર્યું, પ્રતિ મિનિટ પ્રતિ mg આશરે 37 થી 59 nmol સુધી. માઇક્સોથાયાઝોલે તેને 88 ટકા ઘટાડીને લગભગ 4.5 કર્યું, અને રંજકે તેને પાંચગણું વધારીને લગભગ 23 કર્યું. બંનેમાંથી કોઈ પણ અવરોધકની હાજરીમાં મેમ્બ્રેન પોટેન્શિયલનું આંશિક પુનઃધ્રુવીકરણ થયું; પ્રકાશીય માપનના કૃત્રિમ પ્રભાવોને બાકાત રાખવા માટે બે રંજકો (સેફ્રેનિન O અને રેશિયોમેટ્રિક TMRM) વડે માપન કરાયું.

આ લેખમાં ઇલેક્ટ્રોનના હસ્તાંતરણનું સીધું પરીક્ષણ પણ કરાયું, જે પ્રથમ અભ્યાસે ક્યારેય કર્યું નહોતું. બહારથી ઉમેરાયેલું 25 micromolar એસિટિલેટેડ સાયટોક્રોમ c ઊર્જિત માઇટોકોન્ડ્રિયા દ્વારા રિડ્યુસ થયું નહીં, પછી ભલે અવરોધકો હાજર હોય કે ન હોય; પરંતુ રંજક ઉમેરવાથી બંને પરિસ્થિતિઓમાં રિડક્શન થયું. કોષરહિત બફરમાં NADH સાથે રંજકે NADH ના પ્રમાણસર દરે સાયટોક્રોમ c નું રિડક્શન કર્યું. શબ્દોમાં આ લાંબી છલાંગ: રિડ્યુસિંગ ઇક્વિવેલન્ટ્સથી રંજક સુધી, રંજકથી સીધા સાયટોક્રોમ c સુધી, અને Complex IV થી ઓક્સિજન સુધી. આ માર્ગ Complex III ને સંપૂર્ણપણે છોડીને આગળ જાય છે, તેથી બંને અવરોધકોનો બાયપાસ શક્ય છે.

બે વધારાનાં માપનો આ અર્થઘટનને સમર્થન આપે છે. માઇક્સોથાયાઝોલથી સારવાર કરેલા માઇટોકોન્ડ્રિયામાં રંજક ઉમેરતાં NAD(P)H ફ્લુઓરેસન્સ ઘટ્યું, એટલે કે રિડ્યુસિંગ ઇક્વિવેલન્ટ્સ નવા માર્ગમાંથી વહી રહ્યા હતા. ઉપરાંત, 660 nm પર રંજકનું શોષણ દરેક ઉમેરણ પછીના ફેરફારો દર્શાવતું હતું, જ્યારે સેન્ટ્રિફ્યુજ કર્યા પછીના સુપરનેટન્ટે બતાવ્યું કે ઓક્સિડાઇઝ થયેલો રંજક ઊર્જિત માઇટોકોન્ડ્રિયાની અંદર સોગણાથી વધુ પ્રમાણમાં સંકેન્દ્રિત થયો અને પછી પોટેન્શિયલ તૂટી પડતાં બહાર નીકળી ગયો. પ્રોટોનનો હિસાબ પણ સુસંગત છે: પમ્પિંગના પગલાં છોડવાથી ઇલેક્ટ્રોનની જોડી દીઠ 10 ને બદલે આશરે 2 પ્રોટોન બાકી રહે છે, તેથી માત્ર આંશિક પુનઃધ્રુવીકરણ સાથે ઓક્સિજનનો ઝડપી ઉપયોગ એ સાચા બાયપાસનું લક્ષણ છે, તેની વિરુદ્ધનો પુરાવો નહીં.

આ જ તૈયારીમાંથી એવા પ્રતિસાદો મળ્યા કે ઉપરછલ્લું વાંચન ભ્રમમાં મૂકી શકે. અવરોધક સાથે રંજકની હાજરીમાં ADP એ શ્વસન વધારવાને બદલે ઘટાડ્યું, અને પરિવહનના અવરોધે તેને ધીમું કરવાને બદલે ઉત્તેજિત કર્યું, જ્યારે મેમ્બ્રેન પોટેન્શિયલ હજી પણ સામાન્ય દિશાઓમાં બદલાતું હતું. આ પ્રણાલીમાં માત્ર ઓક્સિજનનો વપરાશ જોવો ગેરમાર્ગે દોરે છે.

ત્રીજો અભ્યાસ: યકૃતનો અભ્યાસ, જેમાં Complex I અને II તપાસાયા, III નહીં

Lee અને Boelsterli એ માઉસના યકૃતના માઇટોકોન્ડ્રિયા અને સંવર્ધિત હેપેટોસાઇટ્સનો ઉપયોગ કર્યો, જેમને એફાવિરેન્ઝ (Complex I, IC50 લગભગ 30 micromolar) અને આઇસોનિયાઝિડના મેટાબોલાઇટ હાઇડ્રાઝિન (Complex II, IC50 લગભગ 30 micromolar) દ્વારા નુકસાન પહોંચાડવામાં આવ્યું હતું. લગભગ 30 micromolar રંજકે NADH ઓક્સિડેશન, મેમ્બ્રેન પોટેન્શિયલ અને ATP પુનઃસ્થાપિત કર્યાં, સાથે ઓક્સિડન્ટ્સ અને નેક્રોટિક કોષમૃત્યુ ઘટાડ્યાં. Redox Biology નો સંશોધન લેખ આને એવી કાર્યપદ્ધતિ તરીકે રજૂ કરે છે જેમાં રંજક નુકસાન પામેલા Complex I અને II ને બાયપાસ કરીને ઇલેક્ટ્રોન વહન કરે છે.

આ પરિણામ શૃંખલાના શરૂઆતના ભાગ માટેનો સ્થાપિત સંદર્ભ છે, અને તે Complex III વિશે કશું કહેતું નથી, કારણ કે તેમાં ત્યાં કોઈ અવરોધ મૂકવામાં આવ્યો નહોતો. તે મગજના બેમાંથી કોઈ પણ અભ્યાસને સમર્થન આપી કે નકારી શકતું નથી.

પરિસ્થિતિઓનું સરખામણી કોષ્ટક

Complex III ના બંને અભ્યાસો પોતાની પ્રયોગ-વ્યવસ્થા માટે સાચા હોઈ શકે તેનાં ચાર કારણો

1. અવરોધકનો પ્રયોગ સમાન હસ્તક્ષેપ નહોતો. એક તરફ પ્રતિ ml 1 microgram એકલું એન્ટિમાઇસિન, બીજી તરફ 0.3 micromolar એન્ટિમાઇસિન ઉપરાંત અલગ Qo સ્થળનો અવરોધક. Qo સ્થળે ઇલેક્ટ્રોન પહોંચાડતો રંજકનો માર્ગ ત્યાં જ નિષ્ફળ જાય છે જ્યાં સીધો સાયટોક્રોમ c સુધી જતો માર્ગ સફળ થાય છે. એક સ્થળ બંનેનું પ્રતિનિધિત્વ કરી શકતું નથી.

2. રંજકની માત્રા અને સમય અલગ હતા. મુખ્ય સાંદ્રતાઓ 1 સામે 2 micromolar હતી, અને આ એવો રેડોક્સ ચક્ર ચલાવતો પદાર્થ છે જેના ગ્રહણ અને સીધા સાયટોક્રોમ c રિડક્શન પર સાંદ્રતા અને સમયની અસર પડે છે. માત્રામાં નાના તફાવતો અને માપનના જુદા સમય એક જ નેટવર્કના જુદા માર્ગોને ઉજાગર કરી શકે છે.

3. તૈયારીઓ અલગ હતી. ડિજિટોનિન વડે અલગ કરવાની પદ્ધતિ અને Percoll ગ્રેડિયન્ટ વડે અલગ કરવાની પદ્ધતિ આંશિક રીતે સમાન, પરંતુ સંપૂર્ણપણે એકસરખા નહીં એવા માઇટોકોન્ડ્રિયલ સમૂહો પસંદ કરે છે. પ્રોટીનની સાંદ્રતા પ્રતિ ml 0.1 mg જેટલી સમાન હતી, તેથી તે પરિબળ બાકાત થાય છે, પરંતુ ઉપસમૂહ અને માઇટોકોન્ડ્રિયાની અખંડિતતા નહીં. પ્રજાતિભેદ પરની શંકા પણ દૂર થઈ: બીજા જૂથે માઉસમાં પણ એ જ લક્ષણ પુનઃપ્રાપ્ત કર્યું.

4. સબસ્ટ્રેટની સ્થિતિ નક્કી કરે છે કે રંજક શું કરી શકે છે. ત્રણ સબસ્ટ્રેટ પરિસ્થિતિઓ સામે NADH સાથે સંકળાયેલી જોડીઓ હતી. NADH નો પુરવઠો અને મેમ્બ્રેન પોટેન્શિયલ મળીને નક્કી કરે છે કે રંજક કેટલા ઝડપથી રિડ્યુસ થાય છે અને ક્યાં વિતરિત થાય છે; અને જે માર્ગને ઓક્સિડાઇઝ થયેલા સાયટોક્રોમ c ની નજીક રિડ્યુસ થયેલો રંજક જોઈએ છે, તે આ પસંદગી પર નિર્ભર છે.

બાયપાસના આગામી દાવાને કેવી રીતે વાંચવો

પૂછો કે કયા કોમ્પ્લેક્સને, કયા અવરોધકથી, કયા સ્થળે અને કેટલી માત્રાએ અવરોધાયો હતો. રંજકની સાંદ્રતા અને માપન ક્યારે લેવાયું તે પૂછો. પેશી, પ્રજાતિ, અલગ કરવાની પદ્ધતિ, પ્રોટીનની સાંદ્રતા અને સબસ્ટ્રેટ વિશે પૂછો. અને પૂછો કે પોટેન્શિયલ, શ્વસન, રેડોક્સ સ્થિતિ અને સીધા હસ્તાંતરણનું પરીક્ષણ એકબીજા સાથે સુસંગત છે કે નહીં, કારણ કે અહીં માત્ર ઓક્સિજનનો વપરાશ એક કરતાં વધુ વખત ખોટી દિશા સૂચવતો હતો.

મર્યાદિત સારાંશ યથાવત્ રહે છે. રંજક દ્વારા Complex I નો બાયપાસ સ્વીકૃત છે. Complex III માટે, પ્રતિ ml 1 microgram એન્ટિમાઇસિન અને 1 micromolar રંજક સાથે માઉસના માઇટોકોન્ડ્રિયામાં કોઈ કાર્યાત્મક બાયપાસ દેખાતો નથી; જ્યારે 0.3 micromolar એન્ટિમાઇસિન અથવા 1 micromolar માઇક્સોથાયાઝોલ અને 2 micromolar રંજક સાથે ત્રણ પ્રજાતિઓમાં રંજકથી સીધા સાયટોક્રોમ c સુધી ઇલેક્ટ્રોન હસ્તાંતરણ સાથે આંશિક બાયપાસ દેખાય છે. આ બંને વિધાનો એકસાથે સાચાં હોઈ શકે છે. તેનાથી વધુ વ્યાપક કોઈ પણ નિષ્કર્ષ બહિર્વેશન છે.

સંબંધિત વાંચન વિવાદિત દાવાને નિર્વિવાદ રસાયણશાસ્ત્રના સંદર્ભમાં રાખે છે: ઇલેક્ટ્રોનના ક્રમિક હસ્તાંતરણ માટે મિથિલીન બ્લૂ ઇલેક્ટ્રોનને કેવી રીતે ખસેડે છે, શૃંખલાના શરૂઆતના ભાગના સ્થાપિત કિસ્સા માટે Complex I બાયપાસના પ્રયોગો, બે રંજકો શા માટે જરૂરી હતા તે માટે મેમ્બ્રેન પોટેન્શિયલનાં માપનો અને તેમના કૃત્રિમ પ્રભાવો, અને માત્રા તથા સમયની ગૂંચવણો માટે પ્રયોગશાળામાં રેડોક્સ ચક્ર ચલાવતા પદાર્થોનું હેન્ડલિંગ.