Uusi metyleenisininen ja retikulosyyttivärjäys: eri väriaine ja elävien solujen menetelmä

Opiskelija valmistelee retikulosyyttien laskentaa, tilaa metyleenisinistä, sekoittaa sitä vereen eikä näe juuri mitään. Opiskelutoveri käyttää pulloa, jonka etiketissä lukee uusi metyleenisininen, ja saa näkyviin selkeitä sinisiä säikeitä osassa punasoluista. Ensimmäinen opiskelija olettaa toisen pullon olevan tuoreempi tai väkevämpi. Se ei ole kumpaakaan. Se sisältää eri molekyylin.

Tämä käsitteellinen virhe on useimpien aiheeseen liittyvien sekaannusten taustalla. Nimi antaa ymmärtää, että uusi metyleenisininen olisi paranneltu metyleenisinisen erä. Kemia kertoo muuta. Uusi metyleenisininen N on erillinen fenotiatsiiniväriaine, jolla on oma Colour Index -numeronsa, oma substituenttirakenteensa ja oma standardoitu tehtävänsä hematologiassa. Kun tämä ero on selvä, menetelmän muut osat on helppo ymmärtää: miksi solujen on oltava eläviä värjättäessä, mikä lasketaan retikulosyytiksi, miten Heinzin kappaleet liittyvät asiaan ja milloin briljanttikresyylisinistä käytetään.

Lyhyt vastaus

Hematologinen reagenssi uusi metyleenisininen N tunnetaan yleensä nimellä Basic Blue 24 uuden metyleenisinisen PubChem-tietueessa, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, kaava C18H22ClN3S. Tavallinen metyleenisininen on metyylitioniniumkloridi, Basic Blue 9, sen PubChem-tietueessa, C.I. 52015, CAS 61-73-4, kaava C16H18ClN3S. Rakenteellisesti uudessa metyleenisinisessä on kaksi renkaaseen liittynyttä metyyliryhmää ja etyyliaminosivuketjut, kun taas metyleenisinisessä on dimetyyliaminoryhmät. Tämä ero muuttaa värjäytymiskäyttäytymistä. Hematologian oppikirjoissa tavallista metyleenisinistä kuvataan suhteellisen huonoksi retikulosyyttiväriksi ja uutta metyleenisinistä voimakkaammin ja tasaisemmin värjääväksi. Vertailu on tiivistetty ScienceDirectin uutta metyleenisinistä käsittelevällä aihesivulla.

Kyllä, uusi metyleenisininen on supravitaaliväriaine. Supravitaalivärjäys tarkoittaa elävien solujen värjäämistä elimistöstä ottamisen jälkeen ja ennen fiksaatiota, kuten NCBI:n supravitaalivärjäyksen periaatteita käsittelevässä katsauksessa määritellään. Sekä uusi metyleenisininen että briljanttikresyylisininen kuuluvat tähän ryhmään, ja CLSI:n retikulosyyttistandardi käsittelee uutta metyleenisinistä nimenomaan supravitaaliväriaineena. Opiskelijat yhdistävät tämän joskus fiksoitujen sivelyvalmisteiden Romanowsky-värjäykseen. Tämä ajattelumalli ei toimi tässä. Jos fiksoit ensin, menetelmä lakkaa toimimasta.

Samankaltaisia väriaineiden nimiä selvittäville lukijoille metyylisinisen ja metyleenisinisen vertailu käsittelee toista, laajempaa sekaannusta anionisen triaryylimetaaniväriaineen ja kationisen fenotiatsiiniryhmän välillä. Laboratoriovärjäysten yleiskatsaus sijoittaa supravitaalimenetelmät fiksoituja sivelyvalmisteita käyttävien menetelmien rinnalle, ja verisolujen morfologiaopas osoittaa, miten retikulosyyttien arviointi liittyy laajempaan erittelylaskentaan.

Yksi tuoteluetteloihin liittyvä huomio: uudesta metyleenisinisestä on myös erillinen sinkkikloridin kaksoissuolamuoto, jonka CAS-numero on 6586-05-6. Menetelmäosiossa on siksi ilmoitettava suolamuoto ja toimittaja, ei pelkästään yleisnimeä.

Mitä supravitaalivärjäys oikeastaan tekee

Retikulosyytti on nuori punasolu, joka on menettänyt tumansa mutta jossa on jäljellä ribosomaalista RNA:ta. Värjäämättömässä märkävalmisteessa tämä RNA ei näy. Supravitaaliväriaine pääsee elävään soluun ja saostaa tai kokoaa RNA:n sinisiksi rakeiksi ja säikeiksi. Tämä verkkomainen ja säikeinen materiaali näkyy öljyimmersiossa. Verkosto on siis värjäyksen tuote, ei valmiiksi muodostunut tukiranka, joka vain odottaa väriä. Siksi menetelmän muuttujat — väriaineen pitoisuus, puskuri, veren ja väriaineen suhde, lämpötila ja aika — ovat yhtä tärkeitä kuin väriaineen nimi.

Käytännössä tästä seuraa tarkka työjärjestys: sekoita antikoaguloitu veri ensin väriaineeseen, inkuboi, tee sitten sivelyvalmisteet ja tutki ne fiksoimattomina ja ilman vastavärjäystä. Fiksaatio ennen värjäystä tai heikkoja säikeitä peittävä vastavärjäys tuhoaa tiedon, johon laskenta perustuu.

Toimiva retikulosyyttimenetelmä uudella metyleenisinisellä

Yhtä yleispätevää koostumusta ei ole, joten ilmoita käytetty koostumus. Kolme dokumentoitua muunnelmaa havainnollistaa vaihtelua.

Klassisessa Brecher-tyyppisessä menetelmässä käytetään noin 0.5 prosentin uutta metyleenisinistä ja kaliumoksalaattia. Liuosta ja hyvin sekoitettua EDTA-verta sekoitetaan yhtä suuret tilavuudet, ja seosta inkuboidaan huoneenlämmössä noin 10–15 minuuttia. Varovaisen uudelleensekoituksen jälkeen tehdään ohuita kiilamaisia sivelyvalmisteita, jotka ilmakuivataan ja tutkitaan fiksoimattomina 100x-öljyobjektiivilla. NCBI:n retikulosyyttien laskentamenetelmä kuvaa tämän työnkulun ja siinä käytetyn laskentakehyksen.

Dacien ja Lewisin muunnelmassa käytetään 1.0 prosentin uutta metyleenisinistä sitraattisuolaliuoksessa. Siihen sekoitetaan 2–4 tilavuusosaa verta, ja seosta pidetään 37 C:n lämpötilassa 15–20 minuuttia ennen sivelyvalmisteiden tekemistä. Tuoreessa CLSI H44 -menetelmän harmonisointitoteutuksessa käytettiin laimeampaa, 0.1 prosentin liuosta fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa, jonka pH oli 7.4. Inkubointi tehtiin 20 C:n lämpötilassa 10 minuutin ajan ilman fiksaatiota, kuten vuoden 2026 NMB-harmonisointitutkimuksessa raportoitiin.

Laskentasäännöt ovat samat kaikissa muunnelmissa. Laske solu retikulosyytiksi, kun siinä on vähintään kaksi erillistä siniseksi värjäytyvää raetta tai säikeen osaa. Näin yksittäinen väriainekertymä ei riitä. Laske rutiinityössä vähintään 1,000 punasolua ja ilmoita retikulosyytit prosenttiosuutena. Pienillä prosenttiosuuksilla tilastollinen tarkkuus edellyttää useampia soluja. CLSI H44 -menetelmän katsauksessa todetaan, että retikulosyyttiosuuden ollessa noin 1 prosentti tarvitaan noin 4,400 solua, jotta laskennan vaihtelu saadaan 5 prosenttiin; tämä kuvataan De Gruyterin CLSI H44 -katsauksessa. Millerin okulaarilevy helpottaa suurten solumäärien laskemista. Suodata väriaine tai valmista se tuoreena, sillä saostuma muistuttaa rakeisia inkluusioita.

Heinzin kappaleet samassa valmisteessa

Samassa supravitaalivärjätyssä sivelyvalmisteessa voidaan osoittaa myös Heinzin kappaleita. Ne ovat hapettuneen ja denaturoituneen hemoglobiinin aggregaatteja, eivät jäljellä olevaa RNA:ta. Uudella metyleenisinisellä värjätyissä valmisteissa ne näkyvät pyöreinä kappaleina, usein yksittäisinä ja lähellä solukalvoa. Ne värjäytyvät vaaleamman sinisiksi kuin verkkomainen ja säikeinen materiaali. Ne säilyvät huonosti fiksaatiossa ja vastavärjäyksessä, joten tutki fiksoimaton sivelyvalmiste. Tuoreessa menetelmässä käytettiin 20 mikrolitraa EDTA-verta ja 20 mikrolitraa 1 prosentin uutta metyleenisinistä sekä 15 minuutin inkubointia. Heinzin kappaleita sisältävien solujen osuus määritettiin 250 punasolusta, kuten menetelmän raportoineessa PMC-tutkimuksessa kuvataan.

Kaksi eroa auttaa välttämään virhetulkintoja. Ensinnäkin metyylivioletti ja kristallivioletti värjäävät Heinzin kappaleet voimakkaammin kuin uusi metyleenisininen, kuten ScienceDirectin Heinzin kappaleita käsittelevällä aihesivulla todetaan. Uusi metyleenisininen on kätevä valinta, kun retikulosyyttejä ja Heinzin kappaleita arvioidaan yhdessä, mutta se ei ole voimakkaimmin värjäävä erityinen Heinzin kappaleiden väriaine. Toiseksi alfatalassemiapiirteeseen liittyvät HbH-inkluusiot tuottavat supravitaalivärjäyksen jälkeen lukuisia pieniä pisteitä eri puolille solua, kun taas klassisia Heinzin kappaleita on vähemmän, ne ovat suurempia ja usein liittyvät solukalvoon. Kolmas samankaltainen löydös on väriainekertymä: se sijaitsee solujen tarkennustason ulkopuolella ja vaihtelee näkökentästä toiseen.

Briljanttikresyylisininen verrattuna uuteen metyleenisiniseen

Molemmat väriaineet soveltuvat retikulosyyttien supravitaalivärjäykseen, mutta standardointi suosii niistä toista. CLSI H44-A2 -retikulosyyttimenetelmä, joka on kehitetty yhdessä International Council for Standardization in Haematology -järjestön kanssa ja esitelty CLSI H44 -standardin sivulla, määrittelee EDTA-veren värjäämisen uudella metyleenisinisellä manuaaliseksi vertailumenetelmäksi. Perinteinen hematologian opetus on samaa mieltä ulkonäöstä: uusi metyleenisininen värjää säikeet voimakkaammin ja tasaisemmin, kun taas briljanttikresyylisinisen tulokset vaihtelevat enemmän erien ja näytteiden välillä.

Tähän asemaan liittyy kuitenkin varaus. ICSH:n analysaattorien arviointiohje hyväksyy manuaalisen mikroskopian uudella metyleenisinisellä vertailumenetelmäksi mutta toteaa sen olevan subjektiivinen ja suhteellisen epätarkka. Virtaussytometrisiä vertailumenetelmiä suositaan, kun niitä on käytettävissä. Vuonna 2022 tehdyssä 100 näytteen vertailussa briljanttikresyylisinisen tulosten systemaattinen poikkeama käytetyn analysaattorin tuloksista oli pienempi kuin uuden metyleenisinisen tulosten, kuten PMC:ssä julkaistussa värjäysmenetelmien vertailussa raportoitiin. Opiskelijoille perusteltu yhteenveto on tämä: käytä uutta metyleenisinistä standardoituna manuaalisena vertailumenetelmänä, varmista paikallinen briljanttikresyylisinimenetelmä vertaamalla sitä tähän tai automatisoituun menetelmään ja varaudu manuaalisen mikroskopian suurempaan hajontaan kummallakin väriaineella. Vanhemmassa standardointikirjallisuudessa suositeltiin myös puhdistettua Azure B -väriainetta kemiallisesti puhtaampana vaihtoehtona, koska kaupalliset väriaine-erät vaihtelivat. Tätä käsitellään Marshallin Azure B -tutkimuksessa, mikä selittää, miksi reagenssin laatuluokka esiintyy yhä menetelmäkeskusteluissa.

Tavallisten virheiden välttäminen

Neljä virhettä selittää useimmat epäonnistuneet valmisteet. Tavallisen metyleenisinisen tilaaminen uuden metyleenisinisen N sijaan johtaa heikkoon värjäytymiseen kemian, ei tekniikan vuoksi. Fiksointi tai vastavärjäys ennen tarkastelua poistaa supravitaalivärjäyksen signaalin. Väriaineen saostuman laskeminen rakeiksi suurentaa tulosta; kahden rakeen sääntö ja suodatettu väriaine ehkäisevät tämän. Liian pienen solumäärän laskeminen silloin, kun retikulosyyttien prosenttiosuus on pieni, tuottaa tarkalta näyttävän luvun, jonka luottamusväli on leveä. Jokaisella virheellä on sama tunnusmerkki: mikroskopoija syyttää mikroskooppia tuloksesta, joka määräytyi jo reagenssivaiheessa.