Reaktiivisten happilajien mittaaminen metyleenisinikokeissa

Kaksi laboratoriota tekee kokeen, jota kumpikin kutsuu metyleenisinisen antioksidanttikokeeksi. Toinen raportoi väriaineen vähentävän reaktiivisia happilajeja. Toinen raportoi sen tuottavan niitä. Molemmat esittävät selkeät annosvastekäyrät. Molemmat toimivat vilpittömästi. Ero ei johdu vilpistä tai osaamattomuudesta. Ryhmät mittasivat eri asioita erilaisissa valaistusolosuhteissa käyttäen koettimia, jotka vastaavat eri kysymyksiin, ja kuvasivat sitten molempia vastauksia samalla sanalla: ROS.

Metyleenisininen on molekyyli, jota on vaikea mitata tarkasti, koska se osallistuu kemiaan, jota sen pitäisi havainnoida. Pimeässä se siirtää elektroneja luovuttajien ja vastaanottajien välillä ja palautuu lähtömuotoonsa valmiina uuteen kierrokseen. Valossa se toimii valoherkistäjänä ja siirtyy virittyneeseen triplettitilaan, josta se voi siirtää energiaa hapelle ja muodostaa singlettihappea tai siirtää elektroneja ja muodostaa radikaaleja ja vetyperoksidia. Väriaine voi itse hapettaa, pelkistää, valkaista tai optisesti peittää minkä tahansa järjestelmään lisätyn koettimen. Siksi minkään ROS-mittauksen ensimmäinen kysymys ei ole koskaan se, mikä lukuarvo saadaan. Ensimmäinen kysymys on, mitä määritys todella havaitsee ja miten väriaine vaikuttaa määritykseen.

Amplex Red: kalibroitu vetyperoksidimääritys

Metyleenisinisen ja Amplex Redin yhdistelmä on tämän alan kirjallisuuden parhaiten perusteltavissa oleva pari, kun koeasetelma on toteutettu oikein. Kemia on spesifistä: piparjuuriperoksidaasi käyttää vetyperoksidia hapettaakseen Amplex-substraatin fluoresoivaksi tuotteeksi, resorufiiniksi, likimain yhden suhde yhteen -stoikiometrialla. Näytteen peroksidi muuttuu ilmaisimessa havaittavaksi fluoresenssiksi. Mikään muu tavanomaiseen ROS-joukkoon kuuluva yhdiste ei suoraan käynnistä tätä reaktiota.

Ratkaiseva etu on kalibrointi. Huolellinen tutkija mittaa tunnetut peroksidistandardit samassa puskurissa, samoilla peroksidaasi- ja substraattipitoisuuksilla, samalla inkubaatioajalla ja samoilla optisilla asetuksilla ja vertaa sitten näytteitä tähän käyrään. Menetelmän perustana olevassa eristetyillä aivomitokondrioilla tehdyssä tutkimuksessa tutkijat tekivät juuri näin: he lisäsivät tunnetut peroksidimäärät jokaisen mittausajon lopussa. Tulokset ilmoitettiin nopeuksina pikomooleina minuutissa proteiinimilligrammaa kohti eikä mielivaltaisina fluoresenssiyksikköinä. Juuri tämä tekee hehkusta mittauksen.

Tutkimuksen kolme yksityiskohtaa ansaitsevat tulla jäljitellyiksi. Ensinnäkin tutkijat varmistivat signaalin katalaasilla, joka hajottaa peroksidia. Metyleenisinisen aiheuttama fluoresenssin kasvu pysähtyi, kun katalaasia lisättiin. Tämä vahvisti, että signaali johtui peroksidista eikä optisesta artefaktista. Toiseksi he testasivat valaistusta suoraan sulkemalla virityssäteen sulkimella niin, että näytteet saivat vain kahdeksasosan normaalista valoannoksesta. Signaali pieneni vain yhdeksän prosenttia. Yli yhdeksänkymmentä prosenttia raportoidusta peroksidista ei siis riippunut mittausvalosta. Kolmanneksi he mittasivat peroksidin poistumista erikseen elektrodilla ja havaitsivat väriaineen sekä lisäävän tuotantoa että hidastavan poistumista. Koetin, joka ilmoittaa vain nettofluoresenssin, olisi niputtanut nämä kaksi vaikutusta yhteen.

Määritykseen liittyy silti virhelähteitä, ja metyleenisininen tuo niistä esiin useita. Väriaine absorboi laajasti samalla punaisen valon alueella, jolla resorufiini emittoi. Siksi suurilla väriainepitoisuuksilla näyte voi peittää oman signaalinsa sisäsuodatinvaikutusten vuoksi. Standardien tulee tämän vuoksi sisältää sama väriainepitoisuus kuin näytteiden. Amplex Red voi myös valohapettua itsestään, ja sen tuote resorufiini voi osallistua valon käynnistämään redox-kiertoon, joka tuottaa superoksidia ja peroksidia. Tällä on suuri merkitys, kun kokeessa valaistaan myös valoherkistäjää. Käytännön ratkaisu on säteilyttää ensin metyleenisiniset näytteet ja määrittää sitten niiden osanäytteet Amplex-reagensseilla pimeässä sen sijaan, että väriainetta ja koetinta valaistaisiin yhdessä. Lopuksi superoksididismutaasi ei yksinkertaisesti pienennä Amplex-signaalia: superoksidin muuttaminen peroksidiksi voi kasvattaa sitä. Fluoresenssia lisäävä SOD-kontrolli ei ole epäonnistunut. Se on tunnistanut superoksidin reaktioketjussa aiemmin esiintyväksi lajiksi.

DCFDA: epäspesifinen hapettumisen indikaattori

Metyleenisinisen ja DCFDA:n yhdistelmä on suurimman osan sekaannuksista taustalla. DCFH-DA on soluihin vietävä esiaste. Solun sisäiset esteraasit poistavat sen asetaattiryhmät, jolloin jäljelle jää fluoresoimaton DCFH, ja DCFH:n hapettuminen tuottaa fluoresoivaa DCF:ää. Sitä hapettavien yhdisteiden luettelo on pitkä: hydroksyyliradikaalit, peroksidaasi- ja hemivälituotteet, typpidioksidi, hypokloorihapoke ja peroksinitriitistä syntyvät radikaalit. Pelkkä vetyperoksidi ei hapeta sitä suoraan millään käyttökelpoisella nopeudella. Peroksidista riippuva fluoresenssi tarvitsee yleensä reaktioketjuun rautaa, hemiproteiineja tai peroksidaasikemiaa.

Kritiikki, johon jokaisen menetelmäosion tulisi viitata, on peräisin Kalyanaramanin ja kollegoiden analyysistä DCFH:n käytöstä koettimena. Kuten aivomitokondriotutkimuksessa, jossa DCFDA hylättiin tästä syystä, tiivistetään, he osoittivat koettimen reagoivan hitaasti, tuntemattomalla stoikiometrialla, ilman pätevää kalibrointia ja myös muiden kuin ROS-yhdisteiden kanssa. Koetin myös vahvistaa mittaamaansa ilmiötä: DCFH:n yhden elektronin hapettuminen tuottaa DCF-radikaalin, joka reagoi hapen kanssa muodostaen superoksidia. Tämä dismutoituu edelleen lisäperoksidiksi. Mittaus siis osittain tuottaa itse raportoimansa kemian.

Mikään tästä ei tee DCFDA:sta hyödytöntä. Se tekee siitä seulontamenetelmän, ei tunnistusmenetelmää. DCF-fluoresenssin kasvu tarkoittaa, että hapettimista riippuva koettimen hapettuminen lisääntyi. Se ei tarkoita, että peroksidin määrä lisääntyi, eikä varsinkaan sitä, että ROS:n kokonaismäärä lisääntyi: yksikään koetin ei yksin mittaa tätä suuretta. Aiemmissa metyleenisinistä koskevissa tutkimuksissa, joissa tukeuduttiin DCF:n hapettumiseen yli yhden mikromolaarin pitoisuuksilla, raportoitiin pro-oksidatiivisia vaikutuksia. Samaan aikaan muissa järjestelmissä raportoitiin suojaa peroksidin aiheuttamalta solukuolemalta. Molemmat havainnot voivat pitää paikkansa saman väriaineen kohdalla erilaisissa redox-olosuhteissa, eikä DCF-tulos yksin kerro, mikä hapetin tuotti signaalin. Aiemman aivomitokondriotutkimuksen merkitys on siinä, että seulonta korvattiin kalibroidulla peroksidimittauksella ja kuormitus havaittiin suoraan: jo sadan nanomolaarin väriainepitoisuus lisäsi peroksidin vapautumisen moninkertaiseksi kaikilla testatuilla substraateilla ja kaikissa testatuissa hengitystiloissa.

DCFDA:han liittyy vielä yksi metyleenisiniselle ominainen sudenkuoppa. Väriaine on voimakkaasti värillinen ja redox-aktiivinen, joten se voi valkaista fluoresenssia, sammuttaa emissiota tai hapettaa koetinta solujen ROS:sta riippumatta. Soluton kontrolli, jossa on väriainetta ja koetinta mutta ei soluja, ei ole valinnainen lisä. Se on koe, joka kertoo, reagoiko väriaine koettimen kanssa.

Spinloukutus ja hapenkulutus: tunnistus ja vuo

Kun fluoresoivat koettimet kertovat jonkin hapettavan aineen ilmaantuneen, elektronispinresonanssi spinloukkujen kanssa kertoo tarkemmin, mikä aine oli kyseessä. Klassisessa metyleenisinisen valokemian tutkimuksessa käytettiin ESR:ää väriaineen, askorbaatin ja valon tuottaman askorbaattiradikaalin havaitsemiseen. Sen jälkeen osoitettiin peroksidin muodostuminen hapenkulutuskokeissa ja raudan katalysoima hydroksyyliradikaalien muodostuminen spinloukutuskokeissa. Kukin tekniikka vastasi kysymykseen, johon muut eivät pystyneet vastaamaan: ESR tunnisti radikaalin, hapenkulutus osoitti reaktiovuon fluoresoivista koettimista riippumatta, ja menetelmien yhdistelmä osoitti sekä singlettihappi- että radikaalireittien toimivan samassa valaistussa järjestelmässä.

Tuo vuoden 1984 tulos toimii yhä varoituksena. Valaistuksen ja pelkistimen läsnä ollessa väriaine tuotti peroksidia, ja raudan läsnä ollessa järjestelmä tuotti hydroksyyliradikaalia, joukon reaktiivisinta lajia. Tutkijat yhdistivät tämän silmän askorbaattiin ja kyseenalaistivat harkitsemattoman käytön silmään. Nykyisten lukijoiden tulee huomioida olosuhteet: valo, pelkistin ja rauta yhdessä. Jos yksikin näistä poistetaan, reitti heikkenee tai katoaa.

Happielektrodit ansaitsevat paikkansa toisella tavalla. Clark-tyyppinen elektrodi mittaa hapen nettokulutusta. Se osoittaa väriaineen käynnistämän redox-kemian kuluttavan molekulaarista happea ja antaa kinetiikasta tietoa, jota mikään fluoresenssiartefakti ei voi väärentää. Se ei tunnista tuotetta. Peroksidin, superoksidin ja veden muodostuminen sekä singlettihapen hajoaminen kuluttavat kaikki happea. Vuo ilman tunnistusta on yhtä puutteellinen kuin tunnistus ilman vuota. Siksi vahvoissa tutkimuksissa elektrodi yhdistetään kalibroituun peroksidimääritykseen tai spinloukkuun.

Miksi antioksidanttituloset ovat ristiriitaisia

Kun nämä kolme mittaustapaa asetetaan rinnakkain, metyleenisinistä koskevan kirjallisuuden näennäiset ristiriidat selittyvät menetelmien eroilla ja kolmella biologisella tosiasialla.

Ensinnäkin väriaine on sekä elektronien siirtäjä että peroksidin lähde. Ohjaamalla elektroneja pois hengitysketjun kohdista, joissa happi muuten muuttuisi superoksidiksi, se voi vähentää yhtä ROS-lajia. Samalla sen pelkistynyt muoto pelkistää happea suoraan peroksidiksi ja lisää toista ROS-lajia. Laboratorion, joka tutkii mitokondrioiden redox-kemiaa ja metyleenisinisen ohitusroolia, tulisi siksi odottaa koettimesta riippuvia vastauksia: superoksidille herkkä mittaussignaali pienenee samalla kun peroksidisignaali kasvaa samassa kyvetissä.

Toiseksi peroksidi on pieninä annoksina signaali, ei pelkästään vaurion aiheuttaja. Aiemman työn jälkeen tehdyssä hiiren aivomitokondriotutkimuksessa havaittiin peroksidin muodostumista jo viidenkymmenen nanomolaarin väriainepitoisuudella ilman mitokondrio-DNA:n vaurioita terapeuttisilla pitoisuuksilla sekä esikäsittelyn jälkeistä suojaa rotenonin aiheuttamilta vaurioilta. Vasta sadan mikromolaarin pitoisuudella, selvästi terapeuttisen alueen yläpuolella, väriaine vaurioitti tiettyjä DNA-fragmentteja. Punainen valo yhdessä kahdenkymmenen mikromolaarin väriainepitoisuuden kanssa tuotti singlettihappea, joka vaurioitti kaikkia testattuja fragmentteja. Ehdotettu mekanismi on hormeettinen: vähäinen peroksidituotanto käynnistää Nrf2:een liittyvät antioksidatiiviset puolustusmekanismit ja mitokondrioiden biogeneesin. Näin lyhyen aikavälin pro-oksidatiivinen mittaustulos edeltää pidemmän aikavälin antioksidatiivista lopputulosta. Tunnin kohdalla luettu määritys ja vuorokauden kohdalla luettu määritys voivat antaa eri tuloksia, koska biologia muuttui niiden välillä.

Kolmanneksi valo ratkaisee, mikä molekyyli järjestelmässä ylipäätään on. Valaistus demetyloi väriainetta Azure B:n ja vastaavien tuotteiden suuntaan, ja maljan yläpuolella oleva mikroskoopin lamppu riittää käynnistämään sen valoherkistysvaikutuksen. Pimeässä ja valaistuna tehdyt kokeet ovat eri kokeita, ja jokaisen protokollan valaistuksen ja väriaineen käsittelyn kontrolleja koskevan osion tulisi käsitellä niitä sellaisina.

Vähimmäiskontrollit ja väitteiden tulkinta

Alla oleva vertailu on tämän artikkelin alkuperäinen viiteaineisto. Ennen kuin hyväksyt minkään metyleenisinistä koskevan ROS-tuloksen, tarkista, mitkä rivit tutkijat toteuttivat ja mitkä he ohittivat.

Tästä seuraa käytännöllinen tulkintasääntö. Kalibroitu Amplex-määritys, jossa käytetään peroksidaasia ja katalaasitarkistusta, antaa näyttöä peroksidista. DCFDA antaa näyttöä koettimen epäspesifisestä hapettumisesta eikä mistään muusta. Spinloukutus radikaalinsieppaajakontrolleineen antaa näyttöä radikaalin identiteetistä. Hapenkulutus antaa näyttöä vuosta. Virke, joka väittää enemmän kuin sen määritys voi tukea, kertoo koettimesta eikä väriaineesta, kirjoitettiinpa se kuinka vakuuttavasti tahansa. Aiheeseen liittyvät käsittelyt annosriippuvuudesta ja hormeettisesta alueesta, mitokondrioiden elektronivirrasta, määrityshäiriöistä värjätyissä näytteissä ja mikroskopian valaistusartefakteista täydentävät kutakin näistä näkökohdista. Jokainen niistä pysyy pätevänä, kun sen paikkamerkkiviite korvataan.