Poskisolujen värjäys metyleenisinisellä: mitä havainnoida

Opiskelija asettaa pisaran poskisolususpensiota objektilasille, katsoo mikroskooppiin ja näkee tuskin mitään. Muutama kalpea haamu lipuu kirkkaan näkökentän poikki. Hän tarkentaa, lisää sitten valoa ja päättelee lopulta, että objektilasi on tyhjä. Objektilasi ei ole tyhjä. Solut ovat siinä. Ne ovat lähes läpinäkyviä, ja juuri läpinäkyvyys on ongelma, jonka ratkaisemiseksi tätä värjäystä käytetään.

Tämä odotuksen ja kuvan välinen ristiriita kannattaa nostaa esiin ennen työohjeen aloittamista. Aloittelijat odottavat mikroskoopin paljastavan yksityiskohtia samalla tavoin kuin kameran zoomaus tuo kaukaisen kyltin näkyviin. Kirkaskenttämikroskooppi tekee jotain rajatumpaa: se näyttää valon absorptiossa olevat erot. Värjäämätön poskisolu absorboi tuskin lainkaan valoa, joten se ei juuri erotu ympäristöstään. Metyleenisininen luo tämän eron. Se sitoutuu solun sisällä epätasaisesti ja muuttaa rakenteen kontrastiksi. Kun opiskelijat ymmärtävät tämän ajatuksen, jokainen myöhempi vaihe näyttäytyy sen seurauksena eikä vain reseptinä.

Taustatieto siitä, miten yksinkertaiset värjäykset lisäävät kontrastia koululaboratoriossa, auttaa tässä. Lisäksi kirkaskenttämikroskoopin käyttökuntoon saattamisen kertaaminen ennen värjäystä ehkäisee puolet epäonnistuneista preparaateista. Värin taustalla olevaa kemiaa käsitellään johdannossa metyleenisinisen käyttöön mikroskopiassa, jossa selitetään, miksi juuri tämä väriaine on niin yleinen laboratoriopöydällä.

Työohje opetukseen

Alla kuvattu märkäpreparaatti on yksinkertaisempi perusvaihtoehto tavalliseen opetukseen. Se ei vaadi liekkiä eikä kiinnitysvaihetta. Joissakin korkeakoulujen oppaissa käytetty kiinnitetty sivelypreparaatti sisältää ilmakuivauksen ja lyhyen lämpökiinnityksen, kuten Biology LibreTextsin julkaisemassa North Central Texas Collegen poskisolujen sivelyharjoituksessa. Lämpökiinnitys on kuitenkin mikrobiologinen käytäntö, ei edellytys epiteelisolujen näkemiselle.

Tarvikkeet: puhtaita objekti- ja peitinlaseja, steriilejä kertakäyttöisiä näytteenottotikkuja (ensisijainen vaihtoehto) tai uusia litteitä hammastikkuja, tiputinpullo 0.5–1 prosentin metyleenisinisen vesiliuosta, tislattua tai deionisoitua vettä, imupaperia, suojakäsineet sekä yhdistelmämikroskooppi, jonka kokonaissuurennokset ovat 100x ja 400x.

1. Huuhtele suu pelkällä vedellä. Tämä poistaa ruoantähteitä, jotka myöhemmin värjäytyisivät voimakkaasti ja veisivät huomion soluista.
2. Jokainen opiskelija ottaa näytteen vain omasta poskestaan. Hiero posken sisäpintaa varovasti uudella steriilillä näytteenottotikulla. Paina, älä raaputa. Lopeta hyvissä ajoin ennen epämukavuuden tunnetta tai verenvuotoa.
3. Pyöritä näytteenottotikkua puhtaan objektilasin keskiosan yli niin, että näytteestä muodostuu ohut kerros. Ohut kerros on tärkein yksittäinen tekijä selkeästi tarkasteltavan preparaatin saamisessa. Paksu valkoinen kertymä värjäytyy siniseksi massaksi, josta rakenteita ei voi erottaa.
4. Lisää sivelynäytteen päälle yksi pisara metyleenisinistä. Anna vaikuttaa 1–3 minuuttia. Yksi minuutti riittää monissa korkeakoulujen työohjeissa; NCERT:n luokan IX luonnontieteiden laboratorio-oppaassa tilapäispreparaatin värjäysaika on noin 3 minuuttia. Pidempi aika ei ole parempi, ja liiallinen värjäys on yleisin ajoitusvirhe.
5. Huuhtele varovasti tislatulla vedellä tai ime ylimääräinen väriaine pois imupaperilla paikallisen työohjeen mukaisesti. Taustan pitäisi muuttua vaaleansiniseksi, ei syvän tummansiniseksi.
6. Laske peitinlasi vinossa niin, että yksi reuna koskettaa ensin objektilasia, ja anna sen sitten laskeutua hitaasti. Näin vältät ilmakuplat.
7. Aloita pienellä suurennoksella löytääksesi solut, varmista tarkennus ja keskitys ja siirry sitten 100x-suurennokseen ja lopuksi 400x-suurennokseen. Käytä 400x-suurennoksella vain hienotarkennusta.

Väriaineen pitoisuudesta on syytä tehdä yksi täsmennys. Koulujen työohjeissa käytetään yleensä noin 1 prosentin metyleenisinisen vesiliuosta. Väkevämpi kantaliuos tai pitkä vaikutusaika tummentaa taustaa nopeammin kuin tumaa, mikä kääntää harjoituksen perustana olevan kontrastin päinvastaiseksi.

Poskinäytteen turvallinen käsittely

Poskinäytteissä on sylkeä ja suun normaaleja mikro-organismeja, joten käsittele jokaista tuoretta sivelynäytettä mahdollisesti tartuntavaarallisena materiaalina, vaikka näytteen antajat ovat terveitä opiskelutovereita. American Society for Microbiologyn opetuskäyttöön tarkoitettujen laboratorioiden bioturvallisuusohjeissa esitetään yleiset periaatteet: arvioi riskit ennen harjoitusta, käytä suojakäsineitä, suojaa silmät roiskevaaran yhteydessä, pese kädet työn jälkeen, desinfioi työpöydät ja hävitä likaantuneet kertakäyttötarvikkeet hyväksytyn biologisen jätteen käsittelymenettelyn mukaisesti.

Neljä opetustilanteen sääntöä kattaa suurimman osan riskeistä. Jokainen näytteenottotikku ja objektilasi on vain yhden näytteen antajan käytössä, eikä niitä koskaan jaeta. Näyte otetaan vain itseltä, ei koskaan vierustoverilta. Kertakäyttöiset näytteenottotikut ja hammastikut laitetaan suoraan niille varattuun jäteastiaan, ei koskaan takaisin työpöydälle. Metyleenisininen itsessään värjää ihoa ja vaatteita sekä ärsyttää silmiä, joten suojakäsineitä ja tavanomaisia väriaineiden hygieenisiä käsittelykäytäntöjä tarvitaan. Älä laajenna harjoitusta minkään sivelynäytteessä olevan viljelyyn, äläkä improvisoi tuoreen ihmisperäisen materiaalin lämpökiinnitystä koulun turvallisuusohjeiden ulkopuolella.

Mitä havainnoida ja miksi se näyttää siltä

Etsi 100x-suurennoksella leveitä, litteitä, vaaleansinisiä soluja, joiden ääriviivat ovat epäsäännöllisen soikeita tai monikulmaisia. Ne esiintyvät yksittäin tai löyhinä, päällekkäisinä kerroksina. Jokaisessa solussa on yleensä yksi tummemman sininen piste. Se on tuma. Kiinnitä huomiota myös solujen järjestäytymiseen: levyepiteelisolut ovat ohuita laattoja, eivät palloja, minkä vuoksi niiden reunat muistuttavat halkeillutta lasitetta eivätkä pyöreitä ilmapalloja.

400x-suurennoksella kolme piirrettä erottuu selvästi. Solun raja näkyy ohuena, tummempana viivana, joka ympäröi solua. Solulima täyttää sisäosan vaalean ja tasaisen sinisenä. Tuma on tummempi ja tiiviimpi, usein soikea ja yleensä lähellä keskustaa, mutta ei aina. Pyydä opiskelijoita kirjaamaan kaikki kolme piirrettä sekä solun muoto ja suurennos, sillä tehtävämonisteessa pyydetään juuri näitä tietoja.

Tässä on tärkeä tarkkuuteen liittyvä seikka, joka esitetään monissa tehtävämonisteissa väärin. Näkyvä raja vastaa solukalvon aluetta, mutta itse kalvo, noin 7–10 nanometriä paksu lipidikaksoiskerros, on paljon koulumikroskoopin erotuskyvyn alapuolella. Opiskelijat näkevät solun optisen reunan sekä siihen kertyneen väriaineen. Sama varaus koskee soluelimiä. Mitokondriot, solulimakalvosto, Golgin laitteet ja ribosomit eivät näy tässä preparaatissa. Tavallinen valomikroskooppi erottaa hyvissä olosuhteissa noin 0.2 mikrometrin kokoisia yksityiskohtia, kuten NCBI:n solubiologian taustateksti mikroskopian välineistä selittää. Useimmat hienorakenteet ovat tämän rajan alapuolella tai lähellä sitä. Suurempi tyhjä suurennos kasvattaa kuvaa lisäämättä yksityiskohtia.

Miksi tuma värjäytyy tummimmaksi? Metyleenisininen on kationinen väriaine: liuoksessa sillä on positiivinen varaus, ja se sitoutuu solun negatiivisesti varautuneeseen materiaaliin, ennen kaikkea nukleiinihappoihin. Kromatiini keskittää DNA:n tumaan, joten tumaan kertyy eniten väriainetta. Solulima sisältää RNA:ta ja muita varautuneita molekyylejä, joten sekin värjäytyy, mutta hajanaisemmin ja vaaleammin. Keskeinen tarkennus: metyleenisininen ei ole DNA-spesifinen väriaine. Metyleenisinisen jakautumista tumien kuvantamisessa käsittelevä tutkimus kuvaa kationin sitoutumista runsaasti nukleiinihappoja sisältäville alueille. Vanhemmassa määrällisessä tutkimuksessa metyleenisinisen sitoutumisesta solupreparaateissa havaittiin, että suurin osa sitoutuneesta väriaineesta oli liittynyt nukleiinihappoihin. Tumma tuma ja vaalea solulima muodostavat siis kontrastikuvion, eivät molekyylitason määritystä.

Opiskelijoiden tavalliset virheet ja niiden tulkinta

Lähes jokainen epäonnistunut preparaatti kuuluu johonkin viidestä tyypistä. Opeta opiskelijoita selvittämään preparaatin ongelma sen sijaan, että he vain toistaisivat työn sokkona.

Liiallinen värjäys tekee soluista ja taustasta tasaisen tummia, jolloin tuma katoaa näkökenttään. Korjaa tilanne lyhyemmällä värjäysajalla tai perusteellisemmalla huuhtelulla. Liian vähäinen värjäys jättää näkyviin haamuja, jotka katoavat valon lisääntyessä; lisää aikaa kolmenkymmenen sekunnin jaksoissa. Paksut sivelynäytteet muodostavat tiheitä, päällekkäisiä massoja, joista ääriviivoja ei voi seurata. Korjaus on mekaaninen: levitä näyte seuraavalla kerralla ohuemmaksi, sillä mikään huuhtelu ei pelasta solukasaa. Ilmakuplat näkyvät täydellisinä ympyröinä, joissa on terävät tummat reunat, ja hämäävät aloittelijoita, jotka luulevat niitä rakenteiksi; aseta peitinlasi uudelleen hitaasti ja vinossa. Solujen päällä tai ympärillä olevat pienet tummat pisteet ovat yleensä suun normaaleja bakteereja, kuten koulujen työohjeissa, esimerkiksi Ingrid Sciencen poskusolujen tarkasteluohjeessa, todetaan. Ne osoittavat, että suussa on asukkaita, mikä voi jäädä opiskelijoille mieleen. Niitä ei kuitenkaan voi tunnistaa lajilleen tässä harjoituksessa, eikä niitä pidä piirtää solun osiksi. Ruoantähteet ja limasäikeet värjäytyvät epäsäännöllisesti ja voimakkaasti; alun huuhtelun tarkoitus on vähentää niitä.

Mitä tällä harjoituksella ei voi tehdä

Kyseessä on opetuksellinen havainnointi, ei diagnostinen testi. Solujen ulkonäön perusteella ei voi opetuksessa tehdyllä värjäyksellä diagnosoida infektiota, syöpää tai mitään sairautta, eikä artikkelia pidä tulkita niin, että se väittäisi muuta. Preparaatti näyttää muodon, rajan, soluliman ja tuman kahdella suurennoksella. Se ei näytä solukalvon hienorakennetta, soluelinten yksityiskohtia eikä molekyylien identiteettiä. Rajoituksen selkeä ilmaiseminen suojaa sekä tiedettä että opiskelijoita: hyvä tulos on oikein nimetty piirros, johon on merkitty suurennos ja värjäys, ei päätelmä terveydestä.

Opiskelijan tehtävämoniste ja nimetyt mikroskooppikuvat

Tämän sivun kaksi harjoitusmateriaalia ovat yllä oleva nimetty mikroskooppikuva ja alla oleva tehtävämoniste. Tulosta jokaiselle opiskelijalle oma moniste tai heijasta se näkyviin ja pyydä opiskelijoita kopioimaan laatikot vihkoihinsa.

Käyttö 45 minuutin oppitunnilla: kymmenen minuuttia turvallisuusohjeisiin ja näytteenottoon, kymmenen minuuttia värjäykseen ja preparaatin valmistamiseen, viisitoista minuuttia havainnointiin ja piirtämiseen molemmilla suurennoksilla sekä kymmenen minuuttia tarkistuslistaan ja vertailuun nimetyn mikroskooppikuvan kanssa. Tarkistuslistan kohdat ovat tarkoituksella mekaanisia. Ohut sivelynäyte, oikea värjäysaika, solulimaa tummempi tuma, suurennos kirjattu. Opiskelija, joka voi rastittaa kaikki neljä kohtaa, on ymmärtänyt ajatuksen, jonka opettamiseksi oppitunti on suunniteltu: mikroskoopit näyttävät eroja, ja värjäykset luovat niitä eroja, jotka kannattaa tuoda näkyviin.