Metyleenisinisen mitokondriovaikutusten mittaaminen: happi, ATP ja kalvopotentiaali

Oletetaan, että laboratorio lisää metyleenisinistä mitokondrioihin, joiden hengitys on heikentynyt, ja havaitsee hapenkulutuksen kasvavan. Luonteva johtopäätös olisi kirjoittaa, että väriaine palautti mitokondrioiden toiminnan. Tämä voi olla väärä päätelmä. Happivirtaus, ATP-synteesi ja kalvopotentiaali ovat kolme erillistä käsitettä. Niitä yhdistää sama soluelin samoin kuin varmuuskopiointia, synkronointia ja jakamista yhdistää sama pilvikansio: ne liittyvät toisiinsa, mutta toimivat eri sääntöjen mukaan. Jos yhden sekoittaa toiseen, tulkinta menee pieleen, vaikka kaikki mittaukset olisivat teknisesti oikein.

Metyleenisininen tekee sekaannuksesta todennäköisen, koska se osallistuu mittaamansa järjestelmän toimintaan. Se on redox-kierrättäjä, joka vastaanottaa elektroneja ketjun alkupäässä ja luovuttaa niitä myöhemmin ketjussa, lipofiilinen kationi, joka kertyy energisoituneisiin mitokondrioihin, sekä voimakkaan sininen yhdiste, joka absorboi ja emittoi valoa samoilla aallonpituusalueilla kuin yleiset koettimet. Yksi mittaustulos ei riitä kattamaan kaikkea tätä. Budapestin mitokondriotutkimuksissa osoitettu luotettava toimintamalli on mitata happivirtaus, ATP-synteesinopeus, kalvopotentiaali ja vetyperoksidin vapautuminen sekä käyttää jokaisessa vaiheessa väriainekohtaisia kontrolleja.

Respirometria mittaa happivirtausta, ei energiantuottoa

Korkean erotuskyvyn respirometria, käytettiinpä Oroboros Oxygraph -laitetta tai Seahorse-solunulkoisen virtauksen analysaattoria, kertoo yhden asian: kuinka nopeasti happi pelkistyy. Se ei kerro, montako protonia pumpattiin elektronia kohden, kuinka suuri osa gradientista säilyi tai käyttikö ATP-syntaasi sitä.

Termistöllä on merkitystä. Eristetyissä mitokondrioissa substraatti ilman ADP:tä tuottaa vuotohengityksen, substraatti kyllästävän ADP-pitoisuuden kanssa oksidatiivisen fosforylaation kapasiteetin ja irtikytkijän titraus maksimaalisen elektroninsiirtokapasiteetin. Ehjissä soluissa vastaavat Seahorse-mittaukset ovat perushengitys, oligomysiinille herkkä ATP:hen kytkeytyvä hengitys, protonivuoto, FCCP:llä määritetty maksimaalinen hengitys sekä rotenonille ja antimysiinille resistentti ei-mitokondriaalinen hapenkulutus. Seahorse-tulosten kutsuminen tiloiksi State 3 ja State 4 antaa niille täsmällisyyttä, jota näytevalmiste ei mahdollista, kuten Agilentin Mito Stress Test -kehys tekee selväksi.

Metyleenisininen rikkoo intuitiivisen yhteyden suuremman hapenkulutuksen ja suuremman energiantuoton välillä. Eristetyissä marsun aivomitokondrioissa väriainepitoisuus 100 nM–1 uM lisäsi hapenkulutusta lepotilassa, kun substraatteina käytettiin glutamaattia ja malaattia, sukkinaattia tai alfa-glyserofosfaattia. Alfa-glyserofosfaatilla kasvu oli noin 64 prosenttia, mutta terveiden mitokondrioiden ADP:n stimuloima hengitys pysyi käytännössä ennallaan eristettyjä aivomitokondrioita koskevan tutkimuksen mukaan. Koska vuotohengitys lisääntyi mutta ADP:n stimuloima virtaus pysyi tasaisena, laskennallinen hengityksen kontrollisuhde pienenee. Tämä lasku ei tarkoita, että väriaine vaurioitti mitokondrioita. Se tarkoittaa, että väriaine lisäsi normaalin hengityksen rinnalle happea kuluttavan redox-kierron. Metyleenisinisen hapenkulutusmääritys, jossa raportoidaan vain kasvu, on mitannut todellista kemiallista tapahtumaa mutta ei kertonut mitään energian säilyttämisestä.

Toiminnan palautumista tarkastelevat kokeet osoittavat saman eron suuremmassa mittakaavassa. Kun kompleksi I oli estetty, happivirtaus palautui noin kolminkertaiseksi, mutta ATP-synteesi vain noin 1.5-kertaiseksi. Elektrodille päätyi enemmän happea. Pienempi osa siitä käytettiin ATP:n tuottamiseen. Väite oksidatiivisen fosforylaation paranemisesta tarvitsee tuekseen myös ATP-mittaukset, mieluiten ATP:n ja hapen suhteena ilmaistuna niin, että nimittäjän määrittelytapa kerrotaan.

ATP-määritykset mittaavat synteesinopeutta, jota ATP-määrä ei voi korvata

ATP-määritys vastaa eri kysymykseen: kuinka paljon ATP:tä syntyy aikayksikköä kohden. Kineettinen mittaus tuottaa nopeuden riippumatta siitä, seurataanko tulikärpäsen lusiferaasin luminesenssia minuuttien ajan vai käytetäänkö kytkettyä heksokinaasin ja glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasin määritystä, joka luetaan aallonpituudella 340 nm. Yksittäinen päätepisteessä tehty kokonais-ATP:n mittaus tuottaa määrän, joka heijastaa synteesin ja kulutuksen erotusta eikä yksin kerro paljoakaan oksidatiivisesta fosforylaatiosta.

Budapestin ryhmä käytti kytkettyä entsymaattista menetelmää adenylaattikinaasin toiminta estettynä ja havaitsi, että metyleenisininen pitoisuudella 1–2 uM lisäsi ATP:n tuotantoa maltillisesti mutta merkitsevästi rotenonilla ja antimysiinillä käsitellyissä mitokondrioissa. Tämä on todellista toiminnan palautumista, mutta vain osittaista. TEGDMA:n toksisuutta koskevassa tutkimuksessa päädyttiin samankaltaiseen tulokseen toisessa mallissa: 5 mM hammashoidossa käytettävää TEGDMA-monomeeria romahdutti kompleksiin I kytkeytyvän hengityksen noin 286 virtausyksiköstä 28 virtausyksikköön, ja 2 uM väriainetta palautti sen noin 86 virtausyksikköön.

Värillisen redox-yhdisteen kanssa kaksi kontrollia ovat välttämättömiä. Ensinnäkin käytä oligomysiiniä määrittääksesi, kuinka suuri osa mitatusta ATP-synteesistä riippuu ATP-syntaasista. Toiseksi tee soluton lisäyskokeen saantotesti tunnetulla ATP-määrällä, täydellisellä reagenssiseoksella ja täsmälleen samoilla väriainepitoisuuksilla kuin varsinaisessa kokeessa, vähintään pitoisuuksilla 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM ja 2 uM. Väriaine voi absorboida emittoitua valoa, estää reportterientsyymin toimintaa tai muuttaa reagenssien redox-kemiaa, ja yleisissä lusiferaasimääritysten ohjeissa suositellaan biokemiallisia rinnakkaiskontrolleja juuri tällaisten häiriöiden varalta. Älä oleta pitoisuuden 1 uM olevan artefaktiton vain siksi, että sammuminen on yleensä voimakkaampaa suuremmilla pitoisuuksilla.

Kalvopotentiaalikoettimet mittaavat väriaineen jakautumista, eivät virtausta

Safraniini O, TMRM ja TMRE, rodamiini 123 sekä JC-1 ovat kaikki kalvon läpäiseviä kationeja. Ne kertyvät negatiivisesti varautuneeseen matriksiin sähkökemiallisen tasapainon mukaisesti, joten näytteen kokonaisfluoresenssi kertoo potentiaalista epäsuorasti koettimen sijainnin kautta. Yksikään niistä ei mittaa ATP:tä tai elektronivirtausta.

Kullakin koettimella on sille parhaiten sopiva näytevalmiste. Safraniini O soveltuu eristettyihin mitokondrioihin ja permeabilisoituihin soluihin, tyypillisesti noin pitoisuudella 2 uM, viritysaallonpituuden ollessa noin 495 nm ja emissioaallonpituuden noin 585 nm. Sitä käytetään sammumistilassa, jossa koettimen sisäänotto muuttaa näytteen kokonaisfluoresenssia. TMRM ja TMRE soveltuvat ehjiin soluihin pienillä nanomolaarisilla latauspitoisuuksilla ei-sammuvassa tilassa, jossa depolarisaatio vapauttaa väriainetta ja mitokondrioiden fluoresenssi vähenee. Suurilla latauspitoisuuksilla signaalin suunta voi kääntyä itsesammumisen vuoksi. JC-1 antaa kätevän vihreän ja punaisen signaalin suhteen, mutta se riippuu latauksesta ja mitokondriomassasta, minkä vuoksi se on määrällisessä työssä heikompi kuin huolellisesti kontrolloitu TMRM. Näitä kompromisseja käsitellään laajalti käytetyssä mitokondrioiden kalvopotentiaalikoettimia koskevassa katsauksessa.

Metyleenisininen aiheuttaa optisia häiriöitä juuri käytetyillä työskentelypitoisuuksilla. Sen absorptiokaistat noin 600–665 nm:n alueella osuvat päällekkäin punaisten koettimien emission kanssa, joten sisäsuodatinvaikutukset, sammuminen ja viritysvalon absorptio ovat kaikki mahdollisia. Väriaine on lisäksi toinen lipofiilinen kationi, jonka oma jakautuminen muuttuu mitattavan potentiaalin mukaan. Suojana toimivat rinnakkaiset mittaukset ja nollanäytteet: pelkkä koetin, pelkkä väriaine, koetin yhdessä kunkin väriainepitoisuuden kanssa, täydellinen depolarisaatio FCCP:llä nollavertailuna sekä mieluiten toinen optisesti erilainen koetin. Kompleksin III ohitusta koskevassa tutkimuksessa annettiin tästä esimerkki toistamalla kalvopotentiaalin palautumisen mittaus sekä safraniini O:lla että TMRM:llä antimysiini- ja myksotiatsolieston jälkeen ja havaitsemalla sama laadullinen palautuminen. Yksi optinen reportteri antaa vihjeen. Kaksi toisistaan riippumatonta reportteria antaa näyttöä.

Kolme näytevalmistetta, kolme eri kysymystä

Eristetyt mitokondriot, permeabilisoidut solut ja ehjät solut eivät ole yhden määrityksen keskenään vaihdettavia herkkyysasetuksia. Ne ovat erilaisia koejärjestelmiä, joilla on erilaiset toimintaperiaatteet.

Eristetyissä mitokondrioissa säilyvät elektroninsiirtoketju, sisäkalvo ja matriksin koneisto, mutta solukalvo, sytosoli ja verkoston rakenne poistuvat. Tämä poistaminen on menetelmän tarkoitus: substraatit, ADP, estäjät ja väriainepitoisuudet määritellään tarkasti, jolloin vaikutus voidaan kohdistaa tiettyyn reittiin. Hintana on luontaisen substraattien tarjonnan, signaloinnin ja energiantarpeen katoaminen.

Permeabilisoiduissa soluissa mitokondriot säilyvät suurelta osin solurakenteidensa sisällä, mutta ulkopuolelta lisätyt substraatit ja ADP pääsevät läpi avatusta solukalvosta. Ne ovat oikea työkalu substraattireitin häiriön paikantamiseen soluympäristössä. Liiallinen permeabilisointi vaurioittaa ulkokalvoa, ja sytosolin säätelytekijät huuhtoutuvat pois.

Ehjissä soluissa säilyy kaikki: solukalvon muodostama este, sytosolin pelkistimet, solun oma substraattikuljetus, mitokondrioverkosto ja ATP:n tarve. Ne ovat lähimpänä fysiologiaa mutta kauimpana mekanismin eristämisestä, koska väriaineen sisäänotto, pelkistyminen ja sitoutuminen eri osastoihin vaikuttavat kaikki mitokondrioiden todelliseen altistukseen.

TEGDMA-tutkimuksessa käytettiin tarkoituksellisesti kaikkia kolmea tasoa: eristettyjä aivomitokondrioita väriaineen aikaansaaman hapettumisen ja potentiaalin palautumisen tutkimiseen, permeabilisoituja hammasytimen kantasoluja pääasiassa häiriön paikantamiseen kompleksiin I kytkeytyvään substraattien hapettumiseen sekä ehjiä kantasoluja sen selvittämiseen, mikä oli pitoisuudella 2 uM käytetyn väriaineen fysiologinen nettovaikutus heikentyneeseen hapenkulutukseen. Eri näytevalmisteiden mitokondriomittauksia vertaileville lukijoille rinnakkaisartikkeli siitä, miten metyleenisininen siirtää elektroneja hengitysketjussa, tarjoaa taustatietoa reiteistä, ja metyleenisinisen hengitystutkimusten tulkintaopas käsittelee pitoisuuksien ja estäjien käytön perusteita.

Redox-aktiivisen väriaineen edellyttämät kontrollit

Redox-kierrättäjä tarvitsee tavallista estäjää pidemmän kontrolliluettelon, koska pelkän väriaineen kemia voi jäljitellä biologisia tapahtumia.

Käytä respirometriassa pelkkää puskuria sisältävää kammiota ajautumisen mittaamiseen, puskuria ja väriainetta sisältävää kammiota ilman biologista materiaalia, väriainetta yhdessä määrityksessä mahdollisesti olevan solunulkoisen pelkistimen kanssa sekä lopuksi rotenonia ja antimysiiniä ei-mitokondriaalisen hapenkulutuksen määrittämiseksi ehjissä soluissa. Huomaa, että pelkistynyt väriaine hapettuu uudelleen siirtämällä elektroneja hapelle ja muodostamalla vetyperoksidia. Siksi pelkkää väriainetta sisältävä nollanäyte ilman elektroninluovuttajaa aliarvioi soluttoman hapenkulutuksen, joka syntyy, kun NADH:ta tai NADPH:ta on saatavilla.

Suosi vetyperoksidin mittauksessa kalibroitua Amplex UltraRed -määritystä piparjuuriperoksidaasin kanssa epäselektiivisten DCFDA-väriaineiden sijaan, varmista tulos katalaasilla ja testaa riippuvuus valaistuksesta, sillä väriaine on valoherkistin. Aivomitokondriotutkimuksessa havaittiin, että peroksidikuormitus kasvoi yli nelinkertaiseksi jo väriainepitoisuudella 100 nM samalla, kun peroksidin poistuminen hidastui. Peroksidia muodostui suoraan pelkistyneestä väriaineesta ilman superoksidivälivaihetta. Koettimen valinnan ja valokontrollien yksityiskohtia käsitellään rinnakkaisartikkelissa reaktiivisten happilajien mittaamisesta väriainekokeissa, ja laajempaa kysymystä siitä, milloin peroksidi toimii signaalina ja milloin kuormituksena, käsitellään solujen redox-tasapainon ja antioksidanttiväitteiden yhteydessä.

Reittejä koskevien väitteiden testaamiseksi tutki kompleksin III molemmat estokohdat: antimysiini A Qi-kohdassa ja myksotiatsoli Qo-kohdassa sekä kompleksin IV toiminta ketjun päätepisteessä syanidilla. Aiemmassa hiiren aivoja koskevassa tutkimuksessa raportoitiin, että väriaine palautti rotenonilla estetyn mutta ei antimysiinillä estetyn hengityksen. Myöhemmässä kolmea lajia koskevassa tutkimuksessa havaittiin osittainen palautuminen molemmilla estäjillä sekä näyttöä sytokromi c:n suorasta pelkistymisestä. Pidä ohitusreittiä uudemman aineiston kanssa yhteensopivana tulkintana, älä lopullisesti osoitettuna, sillä väriainepitoisuus, estokohta, substraattitilanne ja väriaineen jakautuminen muuttavat kaikki havaittua reittiä.

Määrityksen valintataulukko

Valitse tämän taulukon avulla mittaus kysymyksen perusteella, älä päinvastoin.

Vakuuttava väite edellyttää vähintään, että samoilla väriainepitoisuuksilla, 100 nM, 300 nM, 1 uM ja 2 uM, mitataan happivirtaus vuotohengitys-, ADP-, oligomysiini- ja irtikytkentäolosuhteissa, ATP-synteesinopeus, kalvopotentiaali mieluiten kahdella koettimella sekä kalibroitu peroksidin vapautuminen katalaasi- ja soluttomine kontrolleineen. Raportoi toisiinsa liittyvät tulokset yhdessä: happivirtaus, ATP-nopeus, ATP:n ja hapen suhde, potentiaali ja peroksidi. Mikä tahansa näistä luvuista yksinään on mittaustulos, joka vielä etsii merkitystään.