Yksinkertainen metyleenisinivärjäys ja gramvärjäys: mitä kumpikin menetelmä voi osoittaa

Opiskelija valmistaa sivelynäytteen viljelmästä, jonka merkintä on E. coli, peittää sen metyleenisinisellä minuutiksi, huuhtelee ja tarkastelee sitä öljyimmersio-objektiivilla. Näkökenttä on täynnä sinisiä sauvoja. Laboratorioraportissa lukee: ”Gramnegatiivisia sauvoja, jotka on tunnistettu E. coliksi.” Havainto on oikea. Tämä objektilasi ei kuitenkaan oikeuta päätelmään.

Virhe on käsitteellinen, ei tekninen. Opiskelija käsitteli yksinkertaista värjäystä kuin se olisi erotteleva testi. Yksinkertainen värjäys ja gramvärjäys vastaavat eri kysymyksiin, koska ne perustuvat erilaisiin värjäysperiaatteisiin. Toinen kysyy, millaisia muotoja näytteessä on. Toinen kysyy, miten soluseinämä käyttäytyy, kun sitä koetellaan. Jos nämä sekoitetaan, oikein värjätystä näytteestä syntyy perusteeton raportti.

Tässä vertailussa menetelmät pidetään erillään, osoitetaan, millaisiin väitteisiin kummankin tulokset oikeuttavat, ja vastataan opiskelijoiden kahteen yleisimpään kysymykseen: voiko metyleenisinistä käyttää gramvärjäyksessä ja mitä E. colin metyleenisinivärjäys todella näyttää.

Lyhyt vastaus

Yksinkertainen metyleenisinivärjäys värjää kaikki värjäytyvät solut saman sinisiksi, joten se näyttää morfologian (sauvat, pallot, spiraalit) ja järjestäytymisen (yksittäin, pareittain, ketjuina), mutta ei kerro mitään gramluokasta. Gramvärjäykseen lisätään jodi, värinpoistovaihe ja vastaväri, joten se erottaa bakteerit grampositiivisiin (violetteihin) ja gramnegatiivisiin (vaaleanpunaisiin tai punaisiin) sen perusteella, miten niiden soluvaipat pidättävät väriainetta. Siniset sauvat metyleenisinivärjäyksen jälkeen tarkoittavat, että ”näytteessä on sauvanmuotoisia soluja”. Vaaleanpunaiset sauvat koko gramvärjäyssarjan jälkeen tarkoittavat, että ”näytteessä on gramnegatiivisia sauvoja”. Jälkimmäinen väite on vahvempi, koska menetelmään sisältyi lisätesti.

Lisätietoa yhden väriaineen bakteerivärjäysmenetelmistä, joihin tämän artikkelin menetelmä kuuluu, on mikroskopian värjäysatlaksessa.

Yksinkertainen värjäys: yksi väriaine, yksi kysymys

Metyleenisininen on emäksinen (kationinen) väriaine. Sen värillinen ioni on positiivisesti varautunut ja sitoutuu solun negatiivisesti varautuneisiin rakenteisiin, kuten nukleiinihappoihin ja pinnan happamiin ryhmiin. Siksi solut näkyvät sinisinä vaaleaa taustaa vasten. OpenStax kuvaa tämän positiivisen värjäyksen periaatteen värjäystä käsittelevässä luvussaan. Väriainekationi itsessään on pieni, litteä fenotiatsiini-ioni, jota käsitellään tarkemmin metyleenisinisen kemian tietokoosteessa; kloridivastaioni ei aiheuta värjäytymistä.

Tavanomainen opetuksessa käytettävä työohje on tarkoituksella yksinkertainen: valmista ohut sivelynäyte, anna sen kuivua ilmassa, kiinnitä kuumentamalla, peitä noin 1% metyleenisinisen vesiliuoksella suunnilleen minuutiksi, huuhtele varovasti vedellä, kuivaa painelemalla ja tutki öljyimmersiolla. LibreTextsin opetuskäyttöön tarkoitettu työohje esittää juuri tämän 1% liuokseen ja minuutin värjäysaikaan perustuvan menetelmän ja huomauttaa, että joissakin laboratorioissa aikaa pidennetään. Ei peittausainetta, ei värinpoistoainetta eikä toista väriainetta. Juuri tämä puuttuminen on olennaista. Kun käytetään vain yhtä väriainetta eikä sitä poisteta valikoivasti, kaikki väriainetta sitovat solut päätyvät samanvärisiksi.

E. colin odotettu näkökenttä sisältää sinisiä sauvoja eli basilleja yksittäin, pareittain tai pieninä ryhminä. Sininen väri tulee väriaineesta. Sauvan muoto tulee organismista. Yhdistelmä ei kuitenkaan tunnista organismia, koska monet lajit ovat sauvamaisia ja monet sauvat värjäytyvät yksinkertaisessa värjäyksessä sinisiksi. ATCC tuo tämän pelkkään morfologiaan rajoittuvan tulkinnan selvästi esiin mikrobiologisessa viljelyoppaassaan. Oikea raportti kuuluu: ”Havaittiin sinisiä basilleja.” Kaikki muotoa ja järjestäytymistä pidemmälle menevät päätelmät tarvitsevat lisää näyttöä.

Gramvärjäys: neljä reagenssia, yksi käyttäytymistä testaava koe

Gramvärjäys on erotteleva värjäys. Kaikki solut käyvät läpi saman käsittelysarjan, ja siinä tarkastellaan, mitkä solut pidättävät ensimmäisen väriaineen ja mitkä menettävät sen. American Society for Microbiologyn gramvärjäysohjeissa määritellään tavanomainen nelivaiheinen järjestys: kristallivioletti (ensisijainen väriaine), Gram-jodi (peittausaine), alkoholi tai asetoni-alkoholi (värinpoistoaine) ja lopuksi safraniini (vastaväri).

Tavanomainen opetuksessa käytettävä malli selittää eron soluvaipan rakenteen avulla. Grampositiivisilla soluilla on paksu peptidoglykaaniseinämä, joka kuivuu ja pidättää kristallivioletti-jodikompleksin alkoholihuuhtelun aikana. Gramnegatiivisilla soluilla on ohut peptidoglykaanikerros ja lipidipitoinen ulkokalvo, jonka värinpoistoaine hajottaa. Siksi kompleksi huuhtoutuu pois ja solut ottavat sen jälkeen vastaan safraniinia. NCBI Bookshelfin gramvärjäystä käsittelevä katsaus esittää tämän soluseinämään perustuvan selityksen. Asiantuntijat huomauttavat, että ilmiön koko fysikaalinen kemia on monimutkaisempi kuin pelkkä seinämän paksuus, mutta laboratoriotulkinnassa käyttäytymissääntö pätee: violetti tarkoittaa värin säilymistä, vaaleanpunainen sen häviämistä ja sen jälkeistä vastavärjäystä.

Havainnollistavat vertailukuvat. Tyyliteltyjä piirroksia menetelmien vertailuun, eivät kameralla otettuja mikroskooppikuvia. Värit on yksinkertaistettu periaatteen opettamiseksi: yksi väri yksinkertaisessa värjäyksessä, kaksi väriä gramvärjäyksen värinpoiston jälkeen.

Voiko metyleenisinistä käyttää gramvärjäyksessä

Kysymyksen voi ymmärtää kahdella tavalla, ja niihin tarvitaan eri vastaukset.

Ensimmäinen tulkinta: voiko yksi metyleenisinikäsittely korvata koko gramvärjäyssarjan? Ei. Ilman jodia, värinpoistoainetta ja vastaväriä ei ole erottelevaa vaihetta, joten gramluokkaa ei testata. Pelkän metyleenisinisen jälkeen näkyvä sininen näkökenttä on yksinkertaisen värjäyksen tulos, vaikka pullo olisi gramvärjäysreagenssien vieressä. Älä kirjaa sitä gramvärjäyksen tulokseksi.

Toinen tulkinta: voiko metyleenisininen korvata safraniinin vastavärinä vaiheessa 4? Toiminnallisesti se voi värjätä värinpoistossa värittömiksi muuttuneet solut, ja oppikirjaharjoituksen perusteella tällaisen vaihdon jälkeen grampositiiviset solut olisivat violetteja ja gramnegatiiviset sinisiä. Päättely on perusteltua, koska oikein käsitellyt gramnegatiiviset solut ovat värinpoiston jälkeen lähes värittömiä ja ottavat vastaan toista kationista väriainetta. Kyse ei kuitenkaan ole vakiomenetelmästä. ASM:n työohjeissa määritellään vastaväriksi safraniini ja joissakin muunnelmissa tunnettuja vaihtoehtoja, kuten emäksinen fuksiini, mutta ei metyleenisinistä. Vaihdolla on myös käytännön haitta: sinistä on vaikeampi erottaa violetista kuin vaaleanpunaista violetista, etenkin aloittelijoiden ja erityisesti kuluneiden mikroskooppilamppujen valossa. Käytä opetustöissä ja kaikissa tuloksiltaan merkityksellisissä tutkimuksissa työohjeessa nimettyä vastaväriä, yleensä safraniinia, ja käsittele metyleenisinivastavärjäystä havainnollistavana muunnelmana, ei samanarvoisena vakiomenetelmänä.

Aiheeseen liittyvää kysymystä metyleenisinisen suhteesta muihin yhden väriaineen vaihtoehtoihin käsitellään yksinkertaisten bakteerivärjäysten vertailussa.

Mitä E. colin metyleenisinivärjäys osoittaa ja mitä ei

E. coli on gramnegatiivinen sauva, mutta tämä lause yhdistää useista menetelmistä saatuja tietoja: morfologia perustuu mikroskopiaan, gramreaktio gramvärjäykseen ja lajin tunnistus viljelyyn sekä biokemiallisiin tai molekyylitesteihin. Metyleenisinisellä värjätty sivelynäyte antaa vain ensimmäisen osan. Se osoittaa, että värjätyssä näytteessä on sauvanmuotoisia soluja, ja näyttää niiden järjestäytymisen. Se ei osoita gramreaktiota, koska värinpoistokoetta ei tehty. Se ei tunnista lajia, koska monien lajien sauvat näyttävät samanlaisilta tällä erotuskyvyllä.

Tässä kohdassa raportit menevät ennakoitavasti harhaan. Kirjoittaja siirtää taustatiedon (”tämän viljelmän pitäisi olla E. coli, ja E. coli on gramnegatiivinen”) havaintoriville, jolloin objektilasi näyttää vahvistavan sen, mikä todellisuudessa oletettiin. Selkeämpi raportti erottaa tietotasot toisistaan: ”Yksinkertainen metyleenisinivärjäys: havaittiin sinisiä basilleja; vain morfologia, gramluokkaa ei testattu.” Jos gramvärjäys on tämän jälkeen tehty oikein kontrolleja käyttäen: ”Gramvärjäys: vaaleanpunaisia sauvoja, mikä vastaa gramnegatiivista tulosta.” Lajin tunnistus tulee myöhemmin tunnistustyönkulusta, ei pelkästä väristä.

Käytännön tulkintaopas

Käytä laboratoriossa tätä päätössääntöä. Jos kaikki solut ovat samanvärisiä ja työohjeessa käytettiin yhtä väriainetta ilman värinpoistoainetta, teit yksinkertaisen värjäyksen. Raportoi muoto, kokoarvio ja järjestäytyminen. Lopeta siihen. Jos työohjeessa käytettiin kristalliviolettia, jodia, värinpoistoainetta ja vastaväriä sekä tunnettuja positiivisia ja negatiivisia kontrolleja, teit gramvärjäyksen. Raportoi väri ja morfologia: violetteja kokkeja ketjuina, vaaleanpunaisia sauvoja ja niin edelleen.

Kolme virhettä selittää suurimman osan sekaannuksista. Ensimmäinen on sinisten sauvojen ylitulkinta E. colin vahvistukseksi. Toinen on metyleenisinillä värjätyn näytteen kirjaaminen muistikirjaan ”Gramvärjäys”-otsikon alle, minkä myöhemmät lukijat tulkitsevat väärin. Kolmas on vastavärien vaihtaminen harkitsemattomasti ja värien vertaaminen laboratorioiden välillä ikään kuin käytetyt värivalikoimat olisivat samat. Kaikkiin virheisiin on sama korjaus: nimeä todella käytetty menetelmä ja väitä vain sitä, mitä kyseinen menetelmä testaa.

Yksinkertainen värjäys ansaitsee paikkansa juuri siksi, että sen väitteet ovat rajallisia. Se on nopea, sietää pieniä vaihteluita ja riittää silloin, kun kysymys koskee morfologiaa: onko näytteessä jotakin ja minkä muotoista se on? Kun kysymys koskee luokittelua, tee erotteleva testi. Sininen objektilasi kertoo, miltä solut näyttävät. Violetti tai vaaleanpunainen objektilasi kertoo, miten niiden seinämät käyttäytyvät. Kumpikaan ei yksin kerro lajia.