Metyleenisininen, Nrf2 ja mitokondrioiden biogeneesi selitettynä

Metyleenisinistä käsittelevissä teksteissä toistuu usein yksi lause: se aktivoi Nrf2:n ja rakentaa uusia mitokondrioita. Lause näyttää yhdeltä väitteeltä, mutta sisältää kaksi eri käsitettä, joita on tutkittu eri järjestelmissä ja joista on erilaista näyttöä. Ensimmäinen on signalointireitti, sensori, joka käynnistää puolustusgeenien toiminnan. Toinen on rakennusohjelma, jossa solu tuottaa lisää mitokondrioiden koneistoa. Signaali voi käynnistää rakentamisen, mutta signaalin käynnistymisen osoittaminen ei ole sama asia kuin valmiin rakennuksen osoittaminen, eikä rakennusmateriaalin lisääntyminen ole sama asia kuin parempi energiansaanti. Tässä artikkelissa nämä kolme asiaa pidetään erillään.

Nrf2:n käsite: sensori, ei suojakilpi

Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2) on transkriptiotekijä eli proteiini, jonka tehtävänä on käynnistää geenien ilmentyminen. Lepotilassa Keap1-niminen sensoriproteiini pitää sen solulimassa ja luovuttaa sen solun hajotuskoneistolle jatkuvasti tuhottavaksi. Kun hapettavat aineet tai elektrofiilit muokkaavat Keap1:n reaktiivisia kysteiinejä, hajotus pysähtyy. Vastasyntynyttä Nrf2:ta kertyy soluun, se siirtyy tumaan, muodostaa pareja pienten Maf-proteiinien kanssa ja sitoutuu DNA-jaksoihin, joita kutsutaan antioksidanttivaste-elementeiksi. Sitoutuminen käynnistää joukon puolustusgeenejä.

Tämän reitin vakiintuneet mittarit ovat tarkasti määriteltyjä. NQO1 (NAD(P)H-kinonidehydrogenaasi 1) ja TrxR1 (tioredoksiinireduktaasi 1) kuuluvat luotettavimpiin Nrf2:n kohdegeeneihin. HO-1 (hemioksigenaasi-1) on voimakkaasti indusoituva, mutta sitä säätelevät myös muut tekijät. SOD:n ja katalaasin kaltaiset entsyymit kuuluvat antioksidanttikoneistoon, mutta niiden määriä säätelevät monet transkriptiotekijät, joten SOD:n lisääntyminen ei yksin todista Nrf2:n olleen syynä. Lähimpänä itse signalointitapahtumaa oleva näyttö on Nrf2:n kertyminen tumaan, ARE-reportterin aktivoituminen tai sellaisten vakiintuneiden kohdegeenien induktio, joka häviää, kun Nrf2 poistetaan. Kaikki muu, kuten hapettavien aineiden määrän väheneminen, parempi selviytyminen stressissä ja suurempi glutationimäärä, on myöhempi vaikutus, jonka monet reitit voivat tuottaa.

Tämän tarinan varhaisin metyleenisinistä koskeva tulos sijoittuu asteikon lähelle itse signalointitapahtumaa. Nanomolaariselle metyleenisiniselle altistetuissa fibroblasteissa soluvanheneminen viivästyi samalla, kun kompleksi IV:n määrä ja hapenkulutus kasvoivat ja vaiheen 2 entsyymit TrxR1 ja NQO1 indusoituivat. Tämä raportoitiin tutkimuksessa, joka ensimmäisenä yhdisti metyleenisinisen mitokondrioiden toiminnan tehostumiseen ja soluvanhenemisen viivästymiseen. TrxR1 ja NQO1 ovat juuri niitä vakiintuneita Nrf2:n kohteita, jotka huolellinen lukija haluaa nähdä. Tutkimus ei kuitenkaan osoittanut itse signalointitapahtumaa: siinä ei mitattu tuman Nrf2:ta, käytetty ARE-reportteria eikä kontrollia, jossa Nrf2-geeni olisi poistettu. Rehellinen tulkinta on siis, että metyleenisininen indusoi tässä järjestelmässä tunnettuja Nrf2:n kohdegeenejä. Tämä sopii yhteen Nrf2:n aktivoitumisen kanssa, mutta ei osoita Nrf2:ta yksiselitteisesti syyksi. Kohdegeenin induktio on yhden vaiheen päässä varsinaisesta kytkimestä.

Biogeneesin käsite: ohjelma, jossa on kolme tarkistuspistettä

Mitokondrioiden biogeneesi on ohjelma, jolla solu lisää mitokondriaalista kapasiteettiaan. Sen oppikirjoissa kuvattu hierarkia kulkee kolmen tarkistuspisteen kautta. Ensin koaktivaattori PGC-1alpha käynnistää ohjelman. Toiseksi tuman transkriptiotekijät ohjaavat mitokondriaalisten geenien ilmentymistä. Hämmentävästi yhden niistä nimi on NRF1 eli nuclear respiratory factor 1, joka on eri proteiini kuin Nrf2. Näihin geeneihin kuuluu TFAM, joka ylläpitää ja monistaa mitokondrioiden DNA:ta. Kolmanneksi solussa on lopulta enemmän mitokondrioiden genomeja ja soluhengityksen koneistoa. Tätä voidaan mitata mtDNA:n kopiolukuna, sitraattisyntaasin aktiivisuutena tai hengitysketjun kompleksien määränä ja aktiivisuutena.

Kukin tarkistuspiste tukee erivahvuista väitettä. PGC-1alpha- tai TFAM-lähetti-RNA:n lisääntyminen osoittaa, että ohjelman käynnistämistä on pyydetty, ei sitä, että se olisi toteutunut loppuun. mtDNA:n tai kompleksi IV -proteiinin lisääntyminen osoittaa materiaalin lisääntyneen, mutta myös mitokondrioiden uudelleenmuokkautuminen voi näyttää samalta. Parempi soluhengitys, suurempi hapenkulutus tai kompleksien aktiivisuus osoittavat toiminnan muuttuneen, mutta toiminta voi parantua ilman yhtäkään uutta mitokondriota. Vahva biogeneesiä koskeva väite yhdistää kaikki kolme: säätelijän, määrän ja toiminnan.

Fibroblasteilla tehty jatkotutkimus kävi läpi suurimman osan tästä ketjusta. Ihmisen IMR90-soluissa, joita käsiteltiin 100 nanomolaarisella metyleenisinisellä, NAD:n ja NADH:n suhde nousi ohimenevästi 15 minuutin kuluessa ja palautui lähtötasolle vuorokauden kuluessa. Tätä ohimenevää energiasignaalia seurasi energiasensori AMPK:n ohimenevä fosforylaatio ja sen jälkeen PGC-1alpha:n sekä SURF1:n induktio. SURF1 on proteiini, jota tarvitaan toimivan kompleksi IV:n kokoamiseen. Kompleksi IV:n aktiivisuus suunnilleen kaksinkertaistui, solunsisäisten hapettavien aineiden määrä laski noin 28 prosenttia ja telomeerit lyhenivät hitaammin. Koko tapahtumaketju kuvataan artikkelissa, joka yhdistää metyleenisinisen redox-aktiivisuuden AMPK:hon ja mitokondrioiden biogeneesiin.

Artikkelissa on kaksi huomiota ansaitsevaa yksityiskohtaa, koska juuri tällaiset yksityiskohdat tavallisesti jäävät pois. Ensinnäkin aktivaation ajallinen luonne oli tärkeämpi kuin sen esiintyminen: metyleenisininen aktivoi AMPK:n ohimenevästi, kun taas vertailulääke AICAR aktivoi sen pitkäkestoisesti. Ohimenevä aktivaattori viivästytti soluvanhenemista noin kahdeksan kertaa tehokkaammin. Väite muodossa ”metyleenisininen aktivoi AMPK:n” on siis puutteellinen. Olennainen väite on, että se aktivoi AMPK:n ohimenevästi, ja vertailu viittaa siihen, ettei pitkäkestoinen aktivaatio saa aikaan samaa vaikutusta. Toiseksi metyleenisininen ei muuttanut solusykliä. Tämä sulkee pois kaikkein arkisimman vaihtoehtoisen selityksen: sen, että solut vain jakautuivat hitaammin ja näyttivät siksi nuoremmilta.

Hiiritutkimusten haara: käyttäytyminen, genomit ja tarkoituksellisen paradoksaalinen laukaisin

Keski-ikäisiä hiiriä tutkiva ryhmä laajensi soluviljelytyön eläimiin. Kun metyleenisinistä oli annettu suun kautta 60 päivän ajan, käsitellyt hiiret säilyttivät enemmän fyysistä kestävyyttään ja tutkivaa käyttäytymistään ja osoittivat vähemmän ahdistuksen kaltaista käyttäytymistä kuin käsittelemättömät ikääntyneet hiiret. Aivokudoksessa ikääntymisen vaimentamien geenien, NRF1:n, TFAM:n, SOD2:n ja kompleksi IV:n alayksikön COX1:n, ilmentyminen palautui kohti aikuisten tasoja, ja mtDNA:n kopioluku kasvoi. Nämä tulokset, joissa yhdistyvät käyttäytyminen, säätelijät ja genomien määrä, raportoidaan keski-ikäisten hiirten tutkimuksessa, joka käsittelee metyleenisinistä ja aivojen mitokondrioiden biogeneesiä.

Ehdotettu laukaisin on kiinnostava, sillä se on ristiriidassa yksinkertaisen käsityksen kanssa, jonka mukaan metyleenisininen on antioksidantti. Käsiteltyjen hiirten aivojen mitokondrioissa reaktiivisten happilajien, erityisesti vetyperoksidin, tuotanto oli lisääntynyt. Kirjoittajien ehdotus on, että lievä peroksidisignaali aktivoi Nrf2-reitin, joka puolestaan käynnistää biogeneesiohjelman. Tässä mallissa metyleenisininen on laukaisuvaiheessa pro-oksidantti ja lopputulosvaiheessa antioksidantti. Farmakologit kutsuvat tällaista ilmiötä hormeesiksi: pieni stressi saa aikaan puolustuksen, joka on itse stressiä suurempi. Sitä, aiheuttaako peroksidin lisääntyminen todella Nrf2:n aktivoitumisen, ei testattu suoraan. Se on ehdotettu yhdistävä tekijä, ei mitattu yhteys.

Saman ryhmän rinnakkaistutkimuksessa koeteltiin ehdotuksen turvallisuuspuolta. Eristetyissä aivojen mitokondrioissa metyleenisininen lisäsi vetyperoksidin tuotantoa jo 50 nanomolaarin pitoisuuksilla, mutta terapeuttiset pitoisuudet eivät aiheuttaneet havaittavia vaurioita mitokondrioiden DNA:han. Vasta 100 mikromolaarin pitoisuudella, joka on huomattavasti terapeuttisia tasoja suurempi, tietyissä mtDNA-fragmenteissa havaittiin vaurioita. Lisäksi 20 mikromolaarin väriainepitoisuuden ja punaisen valon yhdistelmä tuotti singlettihappea, joka vaurioitti mtDNA:ta laajalti. Tämä on väriaineen tunnettua toimintaa valoherkistäjänä, ei sen farmakologista toimintaa pimeässä. Esikäsittely jopa suojasi keskiaivojen ventraalisen osan mitokondrioita rotenonin aiheuttamilta mtDNA-vaurioilta. Annosvaste ja genotoksisuuden kontrollit kuvataan yksityiskohtaisesti tutkimuksessa, joka käsittelee metyleenisinisen ei-genotoksista peroksidituotantoa.

Mitattu ja ehdotettu: kaavion tulkinta

Alla oleva reittikaavio laadittiin tätä artikkelia varten korostamaan tekstissä tehtyä erottelua. Yhtenäisellä viivalla rajatut laatikot kuvaavat vaiheita, joille on suoraa kokeellista tukea metyleenisinistä koskevassa kirjallisuudessa: NAD/NADH-suhdetta muuttava redox-kierto, ohimenevä AMPK:n fosforylaatio, PGC-1alpha:n ja SURF1:n induktio, lisääntynyt kompleksi IV:n aktiivisuus, NQO1:n ja TrxR1:n induktio, biogeneesigeenien ilmentymisen ja mtDNA:n kopioluvun palautuminen hiirten aivoissa sekä peroksidin lisääntyminen ilman mtDNA-vaurioita terapeuttisilla annoksilla. Katkoviivalla rajatut laatikot kuvaavat ehdotettuja yhteyksiä: Keap1:n peroksidisignaalin tunnistamista, puolustusgeenejä aktivoivaa Nrf2:n kertymistä tumaan sekä syy-yhteyttä Nrf2:n aktivoitumisesta biogeneesiohjelmaan. Nämä katkoviivalla merkityt vaiheet ovat uskottavia, sopivat yhteen aineiston kanssa ja kuuluvat tavanomaiseen oppikirjabiologiaan. Näissä artikkeleissa niitä ei kuitenkaan mitattu sellaisilla kontrolleilla (tuman Nrf2, ARE-reportterit, Nrf2-geenin poisto), jotka oikeuttaisivat vaihtamaan laatikoiden reunat yhtenäisiksi.

Kaaviota katsottaessa erottuu kolme sekaannusta. Ensinnäkin NRF1 ja Nrf2 ovat eri proteiineja, joiden nimet ovat lähes identtiset. Hiiritutkimuksessa mitattiin nuclear respiratory factor 1:tä, biogeneesin säätelijää, ei antioksidanttivastetta säätelevää transkriptiotekijää. Niiden sekoittaminen yhdistää koko kaavion yhdeksi solmukohdaksi. Toiseksi geenien ilmentyminen on tarinan alku, ei loppu: TFAM- tai COX1-lähetti-RNA:n palautuminen tukee biogeneesin käynnistämispyyntöä, kun taas mtDNA:n kopioluku ja kompleksi IV:n aktiivisuus ovat näyttöä pyynnön toteutumisesta. Kolmanneksi antioksidanttinen lopputulos ei todista Nrf2-reitin osuutta. Hapettavien aineiden määrän 28 prosentin lasku fibroblasteissa ja suoja rotenonin vaikutuksilta hiirissä ovat todellisia myöhempiä vaikutuksia, mutta useat reitit johtavat niihin.

Mikä muuttaisi katkoviivalla rajatun laatikon yhtenäiseksi

Puuttuvat kokeet ovat tavanomaisia. Tuman Nrf2-proteiinin mittaaminen metyleenisiniselle altistamisen jälkeen samalla aikajaksolla kuin ohimenevä AMPK-signaali testaisi, aktivoituvatko nämä kaksi haaraa todella yhdessä, kuten samanaikaisen aktivaation hypoteesi väittää. ARE-ohjattu reportteri vahvistaisi transkriptionaalisen aktiivisuuden sen sijaan, että se pääteltäisiin kohdegeeneistä. Biogeneesimittausten toistaminen tilanteessa, jossa Nrf2:n ilmentymistä on vähennetty tai sen geeni poistettu, testaisi syy-yhteyttä suoraan: jos kompleksi IV:n induktio ja mtDNA:n lisääntyminen säilyvät ilman Nrf2:ta, ehdotettu yhteys on väärä ja AMPK-haara tuottaa vaikutuksen yksin. Eläintutkimuksessa pitkäkestoista annostelua koskeva koe samoilla kolmella tarkistuspisteellä, säätelijällä, määrällä ja toiminnalla, testaisi, pysyykö ohjelma käynnissä vai mukautuuko se. Siihen asti energia- ja puolustusreittien samanaikainen aktivoituminen on edelleen sitä, miksi sen esittäjät sitä kutsuivat: mahdollinen keskeinen tekijä, ei vakiintunut mekanismi.

Laajemman farmakologian kautta aiheeseen tutustuvat lukijat saattavat kaivata ympäröivää asiayhteyttä: miten metyleenisininen siirtää elektroneja mitokondrioiden tasolla, mitä muuta se tekee mitokondrioille ja solujen energiantuotannolle, miten soluvanhenemista koskevat havainnot sijoittuvat ikääntymistutkimukseen, miten biogeneesiä koskevat väitteet liittyvät kognitiiviseen suorituskykyyn ja millainen turvallisuusnäyttö asettaa rajat kaikelle annostelua koskevalle keskustelulle. Kukin näistä on erillinen käsite, jolla on oma näyttönsä, ja jokainen ansaitsee saman mitattujen tulosten ja ehdotettujen selitysten erottelun, jonka tämä artikkeli teki Nrf2:n kohdalla.