Metyleenisininen ja valoaltistus: aallonpituus, säteilytysvoimakkuus ja käsittelygeometria

Kahdessa tutkimusartikkelissa metyleenisininen altistetaan valolle annoksella 10 J neliösenttimetriä kohti. Toisessa bakteerit kuolevat. Toisessa ei tapahdu mitään mitattavaa. Pelkkää annosta vertaileva lukija päättelee, että tutkimusalan tulokset ovat epäjohdonmukaisia. Ala on johdonmukainen. Annos ei koskaan kuvannut koko altistusta.

Valoaltistus on pieni, yhdessä vaikuttavien parametrien järjestelmä: aallonpituus, säteilytysvoimakkuus, kesto, niistä muodostuva fluenssi, hapen saatavuus, väriaineen pitoisuus ja aggregaatiotila, väriaineen annon ja valotuksen välinen aika sekä optinen kulkumatka, jonka valo todellisuudessa kulkee näytteessä. Muuta yhtä, niin fotokemia muuttuu. Tässä artikkelissa käydään läpi kukin parametri ja erotetaan sitten lähi-infrapunavalolla toteutettava fotobiomodulaatio väriaineen suorasta fotoaktivaatiosta, sillä nämä kaksi toimintatapaa sekoitetaan useimmin toisiinsa.

Aallonpituus ratkaisee, osallistuuko väriaine

Vedessä metyleenisininen absorboi monomeerina voimakkaasti punaista valoa. Absorptiohuippu on noin 664–665 nm:ssä, ja lyhyemmän aallonpituuden puolella on noin 610 nm:ssä olake, joka kasvaa väriaineen aggregoituessa dimeereiksi ja suuremmiksi pinoutuneiksi rakenteiksi. Molaarinen ekstinktiokerroin huipun lähellä on suuruusluokkaa 65,000–85,000 M-1 cm-1, joten jo mikromolaariset liuokset ovat voimakkaan sinisiä. Varhainen fotokemiallinen katsaus metyleenisinisen vuorovaikutuksiin DNA:n ja biologisten substraattien kanssa kuvaa tämän absorptiokäyttäytymisen ja sitä seuraavan viritystilojen kemian: absorptio synnyttää lyhytikäisen singlettitilan, josta tapahtuu siirtymä pitkäikäisempään triplettitilaan noin 0.5:n raportoidulla saannolla. Ilmastetussa liuoksessa happi sammuttaa tämän tilan noin 2 mikrosekunnissa.

Tässä sammutusvaiheessa kaksi fotokemiallista reittiä erkanevat. Tyypin II kemiassa triplettitilassa oleva väriaine siirtää energiaa perustilassa olevalle hapelle ja tuottaa singlettihappea. Yleisesti mainittu saanto on noin 0.52. Tyypin I kemiassa tripletti siirtää sen sijaan elektronin tai vedyn substraatille ja tuottaa radikaaleja, kuten superoksidi- ja hydroksyyliradikaaleja. Molemmat reitit voivat toimia samanaikaisesti, ja tavanomainen fotodynaaminen vaikutus pysyy voimakkaasti happiriippuvaisena myös silloin, kun tyypin I reitti osallistuu siihen.

Metyleenisinisen aallonpituuden valinnassa tästä seuraa yksinkertainen sääntö. Noin 630–680 nm:n punainen valo osuu väriaineen absorptiokaistalle, ja 660–665 nm on lähellä monomeerin absorptiomaksimia. Siksi se voi käynnistää valoherkistimen kemiallisia reaktioita kaikkialla, missä väriainetta on merkittävästi. Lähi-infrapunavalo 810 nm:ssä on selvästi perustilan absorptiokaistan ulkopuolella, joten se soveltuu huonosti väriaineen suoraan virittämiseen. Pitoisuus monimutkaistaa tilannetta yhdellä aidolla tavalla: pitoisuuden kasvaessa yhä suurempi osa väriaineesta on dimeereinä ja aggregaatteina, jotka absorboivat lähempänä 610 nm:ä ja toimivat molekyyliä kohti heikompina valoherkistiminä. Väriaineen määrän kaksinkertaistaminen ei siis kaksinkertaista vaikutusta. Rinnakkaiskatsaus metyleenisiniseen ja punavalohoitoon käsittelee tätä absorptiosääntöä kaikkien valoherkistettyjen reaktioiden edellytyksenä.

Säteilytysvoimakkuus, kesto ja fluenssi ovat kolme parametria, eivät yksi

Fluenssi, yksikkönä J neliösenttimetriä kohti, on säteilytysvoimakkuus kerrottuna ajalla. Pelkän fluenssin ilmoittaminen peittää sen, millä nopeudella energia saapui, ja nopeudella on merkitystä.

Lyhytaikainen suuri säteilytysvoimakkuus ja pitkäaikainen pieni säteilytysvoimakkuus voivat tuottaa saman fluenssin mutta erilaista kemiaa. Suuri säteilytysvoimakkuus kuluttaa liuennutta happea nopeammin kuin diffuusio korvaa sitä, mikä rajoittaa happiriippuvaista tyypin II reittiä kesken altistuksen. Se tuottaa myös lämpöä, ja kudos reagoi lämpenemiseen verenkierron muutoksilla, jotka muuttavat sekä hapetusta että väriaineen jakautumista. Pieni säteilytysvoimakkuus pitkän altistuksen aikana ylläpitää hapen saantia mutta antaa korjausprosesseille ja uudelleenhapettumiselle aikaa toimia jo altistuksen aikana. Fotokemian oppikirjoissa oletusta, että vain kokonaisannos merkitsee, kutsutaan vastavuoroisuusperiaatteeksi. Se ei päde, kun happi, lämpeneminen tai biologia osallistuu prosessiin — kudoksessa siis lähes koskaan.

Ihmisillä toteutettavissa metyleenisinistä käyttävissä antimikrobisissa fotodynaamisissa altistuksissa käytetään yleisesti 6–18 J neliösenttimetriä kohti, mikä on osittain samaa aluetta kuin fotobiomodulaatiossa. Pelkkä fluenssi ei siksi kerro toimintatapaa. Altistus 10 J neliösenttimetriä kohti aallonpituudella 660 nm kudokseen, johon on kertynyt väriainetta, on valoherkistimen ohjaamaa fotokemiaa. Sama fluenssi aallonpituudella 810 nm kudokseen, jossa on vain jäämiä väriaineesta, on aivan muuta. Luku on sama. Käsite on eri.

Optinen kulkumatka ja näytteen geometria ratkaisevat, mitä valo kohtaa

Beer–Lambertin lain mukaisesti näytteen etuosa saa paljon enemmän valoa kuin takaosa. Kyvetissä, jonka väriainepitoisuus on kymmeniä mikromoleja litrassa, ensimmäinen millimetri voi absorboida suurimman osan saapuvasta punaisesta valosta. Syvemmät kerrokset jäävät käytännössä altistumatta. Kun sama liuos sijoitetaan pienenä tilavuutena matalaan kuoppaan, altistuksesta tulee lähes tasainen. Sama väriaine, sama lamppu, sama fluenssi pinnalla — eri tulos.

Kudoksessa absorption lisäksi tapahtuu sirontaa. Punainen valo noin 660 nm:ssä tunkeutuu millimetrien suuruusluokan syvyyteen. Tarkan syvyyden määräävät veripitoisuus, pigmentaatio ja kudostyyppi. Kuopat tuovat omat artefaktinsa: meniskin linssivaikutuksen, seinämistä heijastumisen, reunakuoppien varjostumisen ja pienten tilavuuksien lämpenemisen valonlähteen alla. Kaksi laboratoriota, jotka ilmoittavat samat lampun asetukset mutta käyttävät eri levytyyppejä, tilavuuksia tai etäisyyksiä valonlähteeseen, ovat tehneet eri kokeet.

Etäisyyttä on syytä korostaa, sillä se on yleisin huomaamatta jäävä muuttuja. Säteilytysvoimakkuus pienenee nopeasti etäisyyden kasvaessa ei-kollimoidusta valonlähteestä. Lampun siirtäminen levyn yläpuolella etäisyydeltä 2 cm etäisyydelle 5 cm voi siis pienentää säteilytysvoimakkuutta moninkertaisesti, vaikka menetelmäkuvaus pysyy samana. Jos säteilytysvoimakkuutta ei ole mitattu näytteen pinnalta, valmistajan teholukemista lasketut julkaistut fluenssit ovat arvioita, eivät mittauksia.

Selitteellinen parametriopas: mikä tekee altistuksesta toistettavan

Tätä sivua varten laadittu alkuperäinen aineisto on tarkistuslista. Jos tutkimuksen valoaltistuksesta puuttuvat nämä tiedot, sitä ei voi verrata toiseen altistukseen, vaikka ilmoitettu pääannos näyttäisi kuinka samanlaiselta.

1. Aallonpituus ja kaistanleveys. Huippu ja koko leveys, ei värin nimi. Punainen LED kattaa alueen 630–680 nm, jolla väriaineen absorptio vaihtelee suuresti.
2. Näytteen pinnalta mitattu säteilytysvoimakkuus, yksikkönä mW neliösenttimetriä kohti. Valmistajan ilmoittama wattimäärä ei ole säteilytysvoimakkuus.
3. Kesto ja pulssitus. Jatkuva tai pulssitettu valotus, mukaan lukien pulssitaajuus ja käyttöaste silloin, kun ne ovat sovellettavissa.
4. Edellä mainitusta mitatusta parista laskettu fluenssi, yksikkönä J neliösenttimetriä kohti.
5. Väriaineen pitoisuus, koostumus ja aggregaatiotila. Monomeeri noin 664 nm:ssä toimii valoherkistimenä eri tavalla kuin aggregaatit noin 610 nm:ssä.
6. Lääkeaineen annon ja valotuksen välinen aika. Väriaineen annon ja säteilytyksen väliset minuutit tai tunnit määräävät, missä väriaine on valon saapuessa.
7. Hapetus. Ilmastettu liuos ja vähähappinen kudos muuttavat suoraan tyypin I ja tyypin II reittien tasapainoa.
8. Geometria. Näytteen syvyys, tilavuus, astiatyyppi, valonlähteen etäisyys ja kulma sekä kohteen syvyys kudoksessa.

Hyödyllinen tapa tutkimusartikkeleita lukiessa on tarkistaa ensin lääkeaineen annon ja valotuksen välinen aika. Se paljastaa tarkoituksen. Fotodynaamisissa koeasetelmissa säteilytetään tarkoituksella kudosta, johon on kertynyt väriainetta. Yhdistelmäasetelmissa nämä kaksi voidaan tarkoituksella erottaa toisistaan, kuten jäljempänä.

Lähi-infrapunavalolla toteutettava fotobiomodulaatio ei ole väriaineen fotoaktivaatiota

Fotobiomodulaatio, yleensä lyhennettynä PBM, käyttää punaista tai lähi-infrapunavaloa elimistön oman signaloinnin muokkaamiseen ilman lisättyä valoherkistintä. Fotodynaaminen hoito, yleensä lyhennettynä PDT, käyttää kolmea osatekijää yhdessä: valoherkistimen absorboimaa valoa, itse valoherkistintä ja happea. Niillä synnytetään kohdetta vaurioittava reaktiivisten yhdisteiden ryöppy. Katsaus mitokondrioihin hermoston suojauksen kohteena yhdistää metyleenisinisen ja PBM:n, koska ne vaikuttavat soluhengitykseen eri suunnista: väriaine toimii katalyyttisenä hapetus-pelkistyskierron välittäjänä, joka tukee elektronivirtaa, kun taas PBM:n oletetaan edistävän estävän typpioksidin irtoamista kompleksin IV sytokromi-c-oksidaasista. Tämä entsyymimekanismi on edelleen esitettävä hypoteesina.

Kaksi useimmin siteerattua yhdistelmätutkimusta hiirillä käyttävät molemmat 810 nm:n valoa. Juuri siksi ne eivät osoita väriaineen fotoaktivaatiota. Univajetta edeltävää käsittelyä tarkastelleessa tutkimuksessa hiiret saivat ennen univajetta päivittäin metyleenisinistä 0.5 mg painokiloa kohti, pulssitettua 810 nm:n laservaloa joka toinen päivä tai molempia. Yhdistelmäesikäsittely suojasi muistia mittaavissa käyttäytymistehtävissä suoriutumista ja hippokampuksen synaptisia proteiineja, kun taas yksittäiset käsittelyt jäivät suurelta osin tehottomiksi. Kroonista stressiä ja samanaikaista hoitoa tarkastelleessa tutkimuksessa hiiret saivat 810 nm:n PBM-altistuksen annoksella 8 J neliösenttimetriä kohti sekä päivittäin väriainetta 0.5 mg painokiloa kohti. Laseraltistus annettiin ensin ja väriaine injektoitiin kaksi tuntia myöhemmin nimenomaan siksi, ettei säteilytettäisi kudosta, johon on kertynyt väriainetta. Kaikki kolme tutkimushaaraa korjasivat oppimisvajauksia, ja additiivista hyötyä havaittiin pääasiassa seerumin kortisolissa ja aivojen reaktiivisissa happiyhdisteissä. Näissä tuloksissa testataan kahta yhdessä käytettyä mitokondrioihin kohdistuvaa interventiota. Fotodynaamisten tutkimusten kooste pitää tämän eron näkyvissä kirjaamalla aallonpituuden kunkin käyttöaiheen yhteyteen.

Ihoa koskeva näyttö on toisella puolella tätä eroa. Ihmisillä saadut metyleenisinistä ja valoa yhdistävät ihotutkimustulokset keskittyvät aallonpituuksiin 630–680 nm, paikallisesti tai leesion sisään annettuun väriaineeseen sekä tuhoavaan tai kudosta uudelleenmuokkaavaan tavoitteeseen. Tämä on määritelmän mukaan PDT:tä. Näissä tutkimuksissa havaitun häviämisen käyttäminen todisteena siitä, että väriaine tehostaa PBM:ää, tai 810 nm:n hiiritutkimuksessa havaitun korjaavan vaikutuksen käyttäminen todisteena siitä, että 660 nm:n paneeli ja väriaine muodostavat kognitiota tukevan hoitoprotokollan, sekoittaa toimintatavat. Annostuksen ja farmakologian viiteopas sekä turvallisuus- ja yhteisvaikutusopas käsittelevät tarkemmin tämän kokonaisuuden pitoisuuksiin ja vasta-aiheisiin liittyviä osia.

Nimeä käsite ennen lukujen vertailua. Aallonpituus määrää, absorboiko väriaine valoa. Säteilytysvoimakkuus ja kesto määräävät, mitä kemia tekee tällä absorptiolla. Geometria määrää, mikä osa näytteestä kokee mitään tästä. Kaksi altistusta, jotka ovat samanlaisia yhden parametrin osalta mutta erilaisia muiden osalta, ovat eri kokeita. Niiden pitäminen keskenään samanarvoisina on virhe, jonka tämä opas pyrkii ehkäisemään. Tästä ei seuraa mitään kotikäyttöön tarkoitettua protokollaa: väriaineen absorptioon sopiva valo yhdessä systeemisesti annetun väriaineen kanssa muuttaa muuten säätelevän altistuksen valoherkistimen ohjaamaksi fotokemiaksi, joka kuuluu kliinisten ammattilaisten käsiin.