Metyleenisininen ja rasvamaksa: mitä kokeellisissa tutkimuksissa havaittiin

Rasvamaksa on yhteinen nimitys useille erilaisille ongelmille. Yhdellä ihmisellä sen aiheuttaa pitkäaikainen runsas alkoholinkäyttö. Toisella taustalla ovat liiallinen ravintoaineiden saanti, insuliiniresistenssi ja lisääntynyt rasvan kulkeutuminen maksaan. Mikroskoopissa voidaan molemmissa tapauksissa nähdä pelkkää rasvan kertymistä, mutta taustalla olevat syyt eroavat. Tämä ero ratkaisee, mitä kokeella voidaan osoittaa.

Metyleenisinistä ja rasvamaksaa koskeva tutkimuskirjallisuus on suppea ja tämän kysymyksen osalta kokonaan prekliinistä. Kolmeen rotta- ja hiiritutkimukseen viitataan useimmin, eivätkä niiden tulokset ole yhdenmukaisia. Yhdessä etanoliruokintatutkimuksessa redox-muutos korjaantui, mutta maksan rasvapitoisuus ei muuttunut. Yhdessä runsasrasvaista ruokavaliota käyttäneessä tutkimuksessa maksan rasvapitoisuus väheni samalla kun signalointi muuttui. Yhdessä terveillä eläimillä tehdyssä tutkimuksessa lipidiperoksidaation tulokset olivat maksassa ja munuaisissa vastakkaiset. Yhdessä luettuina ne osoittavat, miksi kolme vastemuuttujaa on pidettävä erillään: redox-muutos, signaloinnin aktivoituminen ja rasvan kertyminen kudokseen.

Kolme vastemuuttujaa, jotka on helppo sekoittaa

Redox-mittaus kuvaa elektronien käsittelyä. Maksan NAD+:n ja NADH:n suhde kertoo, onko soluympäristö suhteellisen hapettunut vai pelkistynyt. Etanolin hapetus muuttaa NAD+:aa NADH:ksi, joten pitkäaikainen alkoholinkäyttö pienentää suhdetta. Elektroneja vastaanottava väriaine voi nostaa sitä takaisin. Tämä on kemiaa, ei näyttöä varastoituneen rasvan vähenemisestä.

Signaloinnin mittaus kuvaa säätelyä. SIRT1 on NAD+:sta riippuvainen säätelyentsyymi, joka muokkaa mitokondrioiden toimintaan ja lipidien käsittelyyn osallistuvia proteiineja. AMPK toimii vähäisen energian saatavuuden tunnistimena, joka aktivoituessaan suosii polttoaineiden hapetusta ja rajoittaa lipidisynteesiä. Kun tutkimus raportoi metyleenisinisen aiheuttamasta SIRT1:n aktivoitumisesta maksassa, se raportoi säätelyn muutoksesta. Se ei vielä raportoi potilaalla saavutettua tulosta.

Histologinen tai biokemiallinen mittaus kuvaa itse maksaa. Tavallisia esimerkkejä ovat triglyseridipitoisuus kudosgrammaa kohti, neutraalirasvan Oil Red O -värjäys, solujen ilmapallomaisen turpoamisen ja vaurioiden arviointi hematoksyliini-eosiinivärjäyksellä sekä plasman ALT-aktiivisuus. Vain tämä kolmas ryhmä vastaa siihen, lievittyikö maksan rasvoittuminen metyleenisinisellä kyseisessä kokeessa.

Näiden ryhmien pitäminen erillään ehkäisee yleisimmän virhetulkinnan: suotuisa redox- tai signalointitulos ei tarkoita maksan rasvoittumisen vähenemistä.

Etanolimalli: redox-tila korjaantui, rasvapitoisuus ei muuttunut

Selkein kielteinen havainto on peräisin urospuolisilla Wistar-rotilla tehdystä pitkäaikaisesta etanoliruokintatutkimuksesta. Eläimet saivat etanolia osana nestemäistä ruokavaliota, ja sen osuus nousi 36 prosenttiin kokonaisenergiasta. Pareittain samansuuruisilla ruokamäärillä ruokitut verrokit saivat glukoosia etanolista saatavan energian tilalle. Yksi etanoliryhmä ja yksi verrokkiryhmä saivat lisäksi metyleenisinistä 130 mg ruokavaliolitraa kohti, noin 42 mg per kg vuorokaudessa, päivästä 5 päivään 30.

Redox-tilaa arvioitiin vakiintuneiden metaboliittiparien avulla: sytosolissa laktaatin ja pyruvaatin suhteella ja mitokondrioissa 3-hydroksibutyraatin ja asetoasetaatin suhteella. Suuriannoksisen etanoliruokinnan alkuvaiheessa etanoliryhmissä havaittiin huomattavia muutoksia: sytosolin NAD+:n ja NADH:n suhde pieneni noin 62 prosenttia ja mitokondrioiden suhde noin 71 prosenttia, ja glyseroli-3-fosfaatin pitoisuus nousi. Metyleenisininen kumosi nämä muutokset suurelta osin ja palautti glyseroli-3-fosfaatin lähelle verrokkien arvoja muuttamatta etanolin saantia, painonnousua tai seerumin etanolipitoisuutta.

Maksan rasvapitoisuus kertoi toisenlaista tarinaa. Päivänä 12, ennen merkittävää rasvan kertymistä, triglyseridipitoisuus ei eronnut ryhmien välillä. Päivänä 27 etanoliryhmien triglyseridipitoisuudet olivat nousseet huomattavasti riippumatta metyleenisinisestä. Päivänä 30 kokonaislipidipitoisuus nousi noin 89 prosenttia ja triglyseridipitoisuus noin 196 prosenttia etanolilla ruokituilla eläimillä, eikä väriaine taaskaan vaikuttanut niihin. Maksalohkusten keskiosien rasvoittuminen näytti samalta hoidon kanssa ja ilman sitä. Kirjoittajat päättelivät, ettei etanolin aiheuttama redox-muutos ole rasvamaksan ensisijainen syy tässä mallissa pitkäaikaisen ruokinnan jälkeen. Tässä auttaa sen ymmärtäminen, miten eläin- ja solulöydökset suhteutuvat ihmiselle aiheutuvaan riskiin: mekanismi voi olla todellinen ilman, että se määrää lopputuloksen.

Tähän tutkimukseen kannattaa viitata, kun joku väittää, että minkä tahansa redox-tilan korjaantumisen täytyy poistaa maksan rasvaa. Tässä koeasetelmassa niin ei tapahtunut.

Aineenvaihduntamalli: signalointia ja vähemmän rasvaa hiirillä

Toisenlainen kuva syntyy maksasoluilla ja runsasrasvaista ruokavaliota saaneilla hiirillä tehdystä tutkimuksesta, joka keskittyi SIRT1:een ja AMPK:hon. HepG2-soluissa, AML-12-soluissa ja rotan primaarisissa maksasoluissa metyleenisininen nosti NAD+:n ja NADH:n suhdetta, lisäsi SIRT1-proteiinin määrää, vähensi PGC-1alpha-säätelijän asetylaatiota, lisäsi mitokondrio-DNA:n määrää ja hapenkulutusta sekä aktivoi AMPK:ta, minkä jälkeen CPT-1:n ja PPARalpha:n määrät kasvoivat. Kun SIRT1:n ilmentymistä vaimennettiin, AMPK:n aktivoituminen jäi pois. Tämä kytkee tapahtumaketjun SIRT1:een kyseisessä solujärjestelmässä. Väriaine myös vastusti LXR-agonisti T0901317:n ja palmitaattialtistuksen aiheuttamia rasvan muodostusta edistäviä signaaleja, mukaan lukien SREBP-1c:n, FAS:n ja ACC:n induktio.

Eläinkokeessa käytettiin urospuolisia C57BL/6-hiiriä, joille annettiin 60 prosenttia rasvaa sisältävää ruokavaliota 8 viikon ajan. Metyleenisinistä annettiin suun kautta neljä kertaa viikossa viimeisten 4 viikon aikana annoksella 3 tai 10 mg per kg vuorokaudessa. Metyleenisinistä saaneilla hiirillä havaittiin vähemmän Oil Red O -värjäytymistä, pienempi maksan triglyseridipitoisuus, vähemmän solujen ilmapallomaista turpoamista ja rasvarappeumaa histologiassa sekä pienempi plasman ALT-arvo kuin hoitamattomilla runsasrasvaista ruokavaliota saaneilla hiirillä. Saman tutkimuksen farmakokineettisessä osassa suun kautta annetun aineen biologinen hyötyosuus oli noin 31–35 prosenttia. Imeytyminen suolistosta oli lähes täydellistä, mutta aineenvaihdunta huomattavaa. Suurin kudos- ja plasmapitoisuuden suhde todettiin maksassa, mikä tekee maksavaikutuksesta ainakin aineen jakautumisen kannalta uskottavan.

Tämä on todellinen viite rasvoittumista vähentävästä vaikutuksesta, mutta sen rajat ovat kapeat. Kyseessä on lyhyt hiirikoe, jossa oli 9–10 eläintä ryhmää kohti, yksi ruokavalio, kaksi annosta ja neljän viikon hoito. Se tutkii aineenvaihduntaperäistä rasvoittumista ja rasvamaksatulehduksen piirteitä, ei alkoholiin liittyvää sairautta. Se ei myöskään tutki kirroosia, fibroosin palautumista tai mitään ihmisillä saavutettavaa tulosta. Mitokondrio- ja redox-mittausten tehtävä tällaisten tulosten tulkinnassa on osoittaa niiden tukevan hypoteesia, ei annostusta tai hoitokäytäntöä.

Tilannekuva terveistä kudoksista: sama annos, vastakkaiset elintulokset

Kolmas tutkimus vedetään usein mukaan maksaa koskeviin väitteisiin, joihin se ei kuulu. Terveillä naaraspuolisilla Wistar-rotilla tehdyssä 30 päivän kokeessa viisi eläintä sai juomavedessä 1 mM metyleenisinistä ja viisi toimi verrokkeina. Superoksididismutaasi, katalaasi ja pelkistynyt glutationi eivät muuttuneet maksassa tai munuaisissa. Lipidiperoksidaatio lisääntyi hieman maksassa ja väheni munuaisissa. Seerumin ALT- ja kreatiniiniarvot laskivat, mutta veren ureatyppi ei muuttunut.

Rehellinen tulkinta on kudoskohtaisuus terveillä eläimillä, ei sairauden hoito. Sama altistus vaikutti yhden merkkiaineen perusteella lievästi hapettumista edistävältä maksassa ja saman merkkiaineen perusteella lievästi suojaavalta munuaisissa, kun taas tavanomaiset antioksidanttipuolustuksen mittarit pysyivät ennallaan. Koska ryhmissä oli viisi eläintä eikä käytössä ollut sairausmallia, tutkimus varoittaa kutsumasta metyleenisinistä yleiseksi maksan antioksidantiksi. Se osoittaa myös, miksi maksaentsyymien muutokset edellyttävät määriteltyä sairauskontekstia ennen kuin ne merkitsevät tilanteen paranemista.

Kolmen maksakokeen vertailu

Taulukko tekee pääasian näkyväksi. Samankaltainen sininen väriaine, erilainen biologia. Etanolitutkimus erottaa redox-tilan onnistuneen korjaamisen rasvapitoisuuteen kohdistuvan vaikutuksen puuttumisesta. Ruokavaliotutkimus yhdistää signaloinnin ja rasvapitoisuuden paranemisen yhdessä mallissa. Terveillä eläimillä tehty tutkimus osoittaa, että redox-merkkiaineet voivat muuttua eri elimissä vastakkaisiin suuntiin.

Miksi näistä ei seuraa hoitoväitettä

Yhteenkään näistä tutkimuksista ei osallistunut rasvamaksaa sairastavia ihmisiä. Annokset, antoreitit ja kestot vaihtelevat tutkimusten välillä, eikä niitä voi muuntaa ihmiselle sopivaksi hoito-ohjelmaksi yksinkertaisella skaalauksella. Pienet ryhmäkoot jättävät huomattavaa epävarmuutta: erityisesti etanolitutkimuksen redox-mittauksissa oli kolme eläintä aikapistettä kohti ja terveiden eläinten tutkimuksessa viisi eläintä ryhmää kohti. Sukupuoli, kanta, ruokavalion koostumus ja hoidon ajoitus suhteessa vaurioon eroavat kaikki toisistaan. Lisäksi kaksi sairausmallia edustavat erilaisia taustasyitä, joten myönteinen ruokavaliotulos ei voi korjata kielteistä etanolitulosta eikä päinvastoin.

Jos henkilöllä on diagnosoitu maksasairaus, tärkeämpää on lukea tuloksia varotoimien kuin hoidon näkökulmasta. Katsaus metyleenisinisen käyttöön liittyviin munuais- ja maksavarotoimiin selittää, miksi elinten vajaatoiminta muuttaa turvallisuuskysymyksiä, vaikka eläintutkimus näyttäisi suotuisalta. Ota lääkärille mukaan diagnoosi, tuoreet laboratoriotulokset, tarkka valmiste ja antoreitti sekä täydellinen lääkityslista. Kysy, millainen näyttö tukee kyseisen valmisteen käyttöä kyseiseen tarkoitukseen henkilöllä, jolla on kyseisenasteinen vajaatoiminta.

Yhteenveto: metyleenisininen muutti maksan redox-tilaa yhdessä etanolimallissa vähentämättä varastoitunutta rasvaa, aktivoi SIRT1:tä ja AMPK:ta samalla kun rasvapitoisuus väheni yhdessä hiirten aineenvaihduntamallissa sekä osoitti elinkohtaisia redox-vaikutuksia terveillä rotilla. Nämä ovat tutkimuksen lähtökohtia, eivät vakiintunut rasvamaksan hoito.