Miksi metyleenisinistä käytetään haponkestävyysvärjäyksen vastavärinä

Laboratoriotyöntekijä tarkastelee yskössivelynäytettä koko värjäyssarjan jälkeen. Punaiset sauvat erottuvat sinistä taustaa vasten, ja lausuntoon kirjataan, että haponkestäviä sauvoja on nähty. Seuraavana päivänä toisella objektilasilla näkyy tasainen sininen kenttä ilman punaisia sauvoja, ja tulos ilmoitetaan tuberkuloosin suhteen negatiiviseksi. Toinen näistä lausunnoista väittää enemmän kuin objektilasi osoittaa, eikä kyse ole ensimmäisestä.

Sekaannus koskee menetelmän periaatetta. Laboratoriotyöntekijä piti sinistä väriainetta osana havaitsemisen kemiaa, ikään kuin metyleenisininen auttaisi löytämään mykobakteerit. Näin ei ole. Kun metyleenisininen koskettaa objektilasia, varsinainen testi on jo ohi. Väriaine vain värjää taustan, jotta tulos voidaan lukea. Tässä artikkelissa selitetään metyleenisinisen tarkoitus haponkestävyysvärjäyksessä, miksi vastaväri on sininen eikä jokin muu ja mitä punaisen erottuminen sinistä vasten oikeuttaa päättelemään.

Lyhyt vastaus

Haponkestävyysvärjäys on erotteleva testi, joka perustuu kolmeen periaatteeseen. Pääväri karbolifuksiini pakotetaan jokaiseen soluun, myös vahamaisiin mykobakteereihin. Värinpoistaja happoalkoholi poistaa punaisen väriaineen tavallisista soluista, mutta ei pysty irrottamaan sitä haponkestävistä soluista. Vastaväri metyleenisininen värjää tämän jälkeen kaiken, mistä värinpoistaja poisti värin. Näin ei-haponkestävät solut, isäntäsolut ja jäännösmateriaali näkyvät sinisinä, kun taas haponkestävät sauvat pysyvät punaisina. Vastaväri luo kontrastin. Se ei osallistu kemiaan, joka tekee solusta haponkestävän.

Mitä kukin vaihe tekee

Alla oleva kaavio esittää työnjaon. Lue sitä vasemmalta oikealle työvaiheina. Alareunan vertailu muistuttaa, että jokainen värjäysmenetelmien ryhmä vastaa eri kysymykseen.

Ensin väriaineen on päästävä solun sisään. Mykobakteerit vastustavat tavallisten vesipohjaisten väriaineiden tunkeutumista, koska niiden soluvaippa on poikkeuksellisen hydrofobinen. Siksi työohjeessa väriaine pakotetaan sisään. Ziehl–Neelsen-menetelmässä höyryäväksi kuumentaminen ajaa fenolia sisältävän karbolifuksiinin vahamaisen seinämän läpi. Kinyounin kylmämenetelmässä kuumennus korvataan huomattavasti vahvemmalla pääväriliuoksella, ja joissakin muunnelluissa kuumentamattomissa versioissa lisätään pinta-aktiivisia aineita. American Society for Microbiologyn haponkestävyysvärjäyksen työohjeissa molemmat koostumukset esitetään rinnakkain. Pitoisuusero on huomattava: kuumennettavassa menetelmässä käytetään noin 0.3 g emäksistä fuksiinia 100 mL:ssa, kun taas kylmämenetelmässä määrä on noin 4 g.

Toisena tulee erottelu. Happoalkoholi, tavallisesti 3 mL väkevää suolahappoa 97 mL:ssa 95-prosenttista etanolia, huuhtoo punaisen väriaineen pois jokaisesta solusta, jonka seinämä ei erityisesti vastusta värinpoistoa. Solut, joiden mykobakteereille ominainen lipidivaippa on ehjä, säilyttävät väriaineen. Koko menetelmä perustuu tähän vaiheeseen, ja se on myös tekniikalle herkin vaihe, kuten jäljempänä käsitellään.

Kontrasti luodaan viimeiseksi. Objektilasilla on nyt punaisia haponkestäviä soluja lähes värittömällä taustalla, jonka muodostavat värinsä menettäneet solut. Metyleenisininen pitoisuudella 0.3 prosenttia w/v tekee taustan jälleen näkyväksi värillä, joka poikkeaa punaisesta mahdollisimman paljon. Vastavärjäys on lyhyt: kuumennettavassa menetelmässä tavallisesti 20–30 sekuntia ja joissakin kylmämenetelmän muunnelmissa enintään muutamia minuutteja. Aika määräytyy työohjeen mukaan eikä ole itse väriaineen ominaisuus.

Miksi tämä väriaine ja miksi sininen

Metyleenisininen on kationinen emäksinen väriaine. Sen värillisellä ionilla on siis positiivinen varaus, ja se sitoutuu värinsä menettäneiden bakteerien, isäntäsolujen ja jäännösmateriaalin negatiivisesti varautuneisiin pintoihin. OpenStaxin mikrobiologian oppikirja kuvaa tämän varausperiaatteen emäksisten väriaineiden yleiseksi toimintaperiaatteeksi. Metyleenisininen ei kuitenkaan ole tässä kemiallisesti ainutlaatuinen. Myös kristallivioletti ja safraniini ovat emäksisiä väriaineita. Valinta on optinen, ei kemiallinen.

Punaiset sauvat tarvitsevat taustan, jonka sävy muodostaa kontrastin, ja sininen erottuu punaisesta kirkaskenttämikroskopian kannalta hyödyllisimmällä tavalla. Safraniini olisi huono vastaväri, koska sen tuottama vaaleanpunainen tai punainen lopputulos on liian lähellä soluihin jäänyttä karbolifuksiinia. Se häivyttäisi juuri sen eron, jonka menetelmä loi. Kristallivioletti tuottaisi tumman violetin taustan, joka kilpailisi huomiosta ohuiden punaisten sauvojen kanssa. Vahvin näyttö siitä, että tehtävänä on kontrastin luominen eikä kemiallinen erottelu, on korvattavuus: joissakin eläinlääketieteellisissä ja muunnelluissa työohjeissa käytetään vihreitä vastavärejä, kuten malakiittivihreää ja briljanttivihreää. Testi toimii silti, koska mikä tahansa selvästi erottuva sävy hoitaa saman tehtävän.

Tästä seuraa kaksi käytännön huomiota. Ensinnäkin vakioreseptissä ei määritellä pH:n säätöä. Tätä tavallista 0.3-prosenttista vesiliuosta ei pidä sekoittaa emäksisiin koostumuksiin, kuten Loefflerin metyleenisiniseen, jotka kuuluvat toiseen värjäysperiaatteeseen. Toiseksi liiallinen värjäys haittaa. Histologian kirjallisuudessa varoitetaan nimenomaisesti, että liian voimakas sininen tausta voi peittää vähälukuiset sauvat. Objektilasin pitäminen väriaineen peitossa työohjetta pidempään heikentää siis luettavuutta tuomatta mitään hyötyä.

Testin mahdollistava soluseinämän kemia

Happoalkoholin erottelukyky perustuu mykobakteerin soluvaippaan. Sen rakenteellinen ydin on mykolyyli-arabinogalaktaani-peptidoglykaanikompleksi: peptidoglykaani on liittynyt arabinogalaktaaniin, jonka ulompiin päihin on kiinnittynyt hyvin pitkäketjuisia mykolihappoja. Ne muodostavat runsaasti lipidejä sisältävän ulomman mykomembraanin, jonka läpäisevyys on poikkeuksellisen pieni. Mykobakteerien ulkokalvoa käsittelevä katsaus kuvaa tämän rakenteen yksityiskohtaisesti. Este toimii molempiin suuntiin. Se vastustaa väriaineen pääsyä sisään, minkä vuoksi tunkeutumiseen tarvitaan kuumennusta tai vahvempaa pääväriä. Se vastustaa myös väriaineen poistumista, minkä vuoksi happoalkoholi ei pysty poistamaan karbolifuksiinia sen päästyä sisään. Tavallisilta bakteereilta tämä vaippa puuttuu, ja ne menettävät väriaineen. Haponkestävyys onkin parasta ymmärtää lipidiesteeseen perustuvana ilmiönä eikä fuksiinin kemiallisena sitoutumisena mykolihappoon.

Tämä kemia selittää myös tavallisen pulman: mykobakteerit värjäytyvät Gram-menetelmällä heikosti ja arvaamattomasti. Ne voivat näkyä himmeinä, helminauhamaisina muotoina tai värjäytymättöminä haamusoluina. Niiden hydrofobinen seinämä rajoittaa kristallivioletin tunkeutumista. Haponkestävyysvärjäys ei ole muunneltu Gram-värjäys. Sen erotteluperiaate on toinen ja perustuu eri soluseinämän ominaisuuteen, kuten yksinkertaisen värjäyksen ja Gram-värjäyksen vertailu osoittaa kahden muun menetelmän osalta.

Kolme menetelmää, kolme kysymystä

Laajempaa yhden väriaineen bakteerivärjäysten ryhmää käsitellään mikroskopian värjäysatlaksessa.

Mitä punainen sinistä vasten ei voi osoittaa

Punaiset sauvat tarkoittavat, että mikro-organismit säilyttivät karbolifuksiinin happoalkoholikäsittelyssä. Löydös sopii Mycobacterium tuberculosis -bakteeriin, mutta CDC:n tuberkuloosin diagnostiikkaohje huomauttaa nimenomaisesti, että muutkin mykobakteerit ovat haponkestäviä. Lajin tunnistamiseen tarvitaan siis viljelyä ja nukleiinihappotutkimuksia, ei pelkkää väriä.

Tekniikkavirheet keskittyvät kahteen huuhteluvaiheeseen. Riittämätön värinpoisto jättää taustamateriaalin punaiseksi ja altistaa väärille positiivisille tulkinnoille. Liiallinen värinpoisto irrottaa heikosti säilyneen päävärin ja lisää väärien negatiivisten tulosten riskiä. Liian voimakas vastavärjäys peittää vähälukuiset sauvat siniseen. Paksut sivelynäytteet, saostuneet reagenssit ja kontaminoitunut huuhteluvesi aiheuttavat omia artefaktejaan.

Mikro-organismien määrä rajoittaa herkkyyttä riippumatta siitä, kuinka huolellinen tekniikka on. Tavanomainen sivelynäytteen mikroskopia edellyttää noin 5,000–10,000 sauvaa yskösmillilitraa kohden. Vanhemmissa CDC:n näyttökatsauksissa sivelynäytteen herkkyydeksi arvioitiin noin 45–80 prosenttia viljelyllä varmistetuissa keuhkotuberkuloositapauksissa. Negatiivinen sivelynäyte ei siis koskaan sulje pois tuberkuloosia. Nykyinen CDC:n ohjeistus edellyttää viljelyä jokaisen sivelynäytteen rinnalla ja suosittelee nukleiinihapon monistustutkimusta vähintään yhdestä hengitystienäytteestä, kun keuhkotuberkuloosia epäillään ja tulos vaikuttaisi hoitopäätöksiin.

Käytännön työssä on noudatettava hyväksyttyjä työohjeita

Opetuskäyttöön tarkoitetut kuvaukset, mukaan lukien tämä artikkeli, eivät anna valtuutusta kliiniseen työhön. Laboratoriotyössä on noudatettava laboratorion validoitua vakiotyöohjetta, joka vastaa ajantasaisia CDC:n, APHL:n tai CLSI:n asiakirjoja. CDC:n Stacks-arkistossa oleva haponkestävyysvärjäyksen ohje näyttää, miten tällaisissa ohjeissa määritellään reagenssit ja tulosten lukeminen. Tuberkuloosinäytteiden käsittely edellyttää suojaavia työjärjestelyjä: sivelynäytteet valmistetaan biologisessa turvakaapissa, koska valmistus synnyttää aerosoleja ja roiskeita. CDC:n laboratorioturvallisuusohjeiden mukaan myös lämpökiinnitetyt sivelynäytteet voivat sisältää elinkykyisiä tuberkuloosibakteereja, joten niitä on edelleen käsiteltävä kontaminoituneina. CDC:n Public Health Image Library -kuvakirjaston kuvaus karbolifuksiinilla ja metyleenisinisellä värjätystä sivelynäytteestä, jota tutkitaan M. leprae -bakteerin varalta, muistuttaa hyödyllisesti menetelmän tuberkuloosia laajemmasta käyttöalueesta: sama punaisen ja sinisen kontrasti palvelee kaikkialla, missä etsitään haponkestäviä mikro-organismeja. Myös huolellisesti todettu negatiivinen löydös on kirjaamisen arvoinen tulos.

Valmiin objektilasin tarkastelu

Vastaväri osoittaa hyötynsä seulontavaiheessa. Pienellä suurennuksella näytettä läpikäyvä mikroskopoija arvioi ensin sinisen taustan avulla sivelynäytteen laadun: solujen tasaisen jakautumisen, tarkennukseen sopivat ehjät isäntäsolut ja runsaan saostuman puuttumisen. Punaiset mahdolliset sauvat kiinnittävät huomion juuri siksi, ettei mikään muu objektilasilla ole punaista. Varmistus tehdään öljyimmersiossa, jossa aidot sauvat näkyvät odotetun ohuina, joskus hieman kaarevina tai helminauhamaisina, eivät tasamuotoisina väriainejäännöksinä.

Taustavärjäys ohjaa myös lausunnon sanavalintoja. Objektilasista, jolla on punaisia sauvoja, ilmoitetaan, että haponkestäviä sauvoja on nähty. Usein mukaan liitetään laboratorion asteikon mukainen puolikvantitatiivinen luokitus. Objektilasista, jolla ei ole punaisia mikro-organismeja, ilmoitetaan, ettei haponkestäviä sauvoja ole nähty — ei koskaan, että tulos olisi tuberkuloosin suhteen negatiivinen. Ero on tärkeä, koska sininen kenttä osoittaa värjäyksen toimineen, solujen ottaneen vastaväriä ja optiikan olleen riittävä, mutta ei kerro mitään havaitsemisrajan alapuolelle jäävistä mikro-organismeista. Tyhjä sininen kenttä on pätevä tulos objektilasista, ei päätelmä potilaan tilanteesta.

Kun työnjako pidetään mielessä, lausuntojen muotoilu on selvää. Karbolifuksiini tuo mahdolliset kohteet esiin. Happoalkoholi tekee varsinaisen testin. Metyleenisininen vain tekee vastauksen luettavaksi: punainen säilytti väriaineen happokäsittelyssä, sininen menetti sen. Kaikki muu — laji, määrä ja kliininen merkitys — selvitetään objektilasin ulkopuolella tehtävillä tutkimuksilla.