Metyleenisininen ja autofagia: AMPK, mTOR ja hermosolukokeet

Kuvittele tekeväsi solukokeen, jossa lisäät metyleenisinistä ja huomaat LC3-II-nimisen proteiinivyöhykkeen tummenevan immunoblotissasi. On houkuttelevaa ilmoittaa yhdisteen ”tehostavan autofagiaa” ja jatkaa eteenpäin. Tällainen tulkinta on ennenaikainen. Tummempi LC3-II-vyöhyke voi tarkoittaa, että solu muodostaa enemmän siivousrakkuloita, tai että rakkuloita kertyy, koska niiden sisällön hävittäminen on estynyt. Nämä kaksi tulkintaa viittaavat vastakkaisiin suuntiin, ja hermosoluja koskevassa metyleenisinikirjallisuudessa on esimerkkejä kummankin tyyppisestä näytöstä. Tässä artikkelissa käydään määritys kerrallaan läpi, mitä todella mitattiin.

Makroautofagia, jota tässä tutkittiin, on solun laajamittaista kierrätystä. Fagoforiksi kutsuttu kalvopussi kasvaa kuluneiden proteiinien ja soluelinten ympärille, sulkeutuu autofagosomiksi ja fuusioituu lysosomin kanssa. Sen sisältö hajotetaan ja vapautetaan uudelleenkäyttöön. Hermosolut ovat riippuvaisia tästä toiminnasta, koska ne eivät jakaudu eivätkä voi siten vähentää vaurioituneiden osien suhteellista määrää jakautumalla. Kun kierrätys pysähtyy, jätettä kertyy. Kun se toimii, solu saa stressitilanteessa rakennusaineita takaisin käyttöönsä.

Mitä yksi hippokampussoluilla tehty koe osoitti

Keskeisessä induktiotutkimuksessa käytettiin hiiren hippokampuksesta peräisin olevia HT22-soluja, joita stressattiin poistamalla seerumi 24 tunniksi. Tämä poistaa kasvutekijöitä ja troofisia signaaleja ja käynnistää sekä apoptoosin että autofagian. Tutkijat raportoivat, että metyleenisininen vähensi solukuolemaa annosriippuvaisesti ja että tähän suojaan liittyi makroautofagian merkkejä.

Markkereista saatu näyttö oli yksityiskohtaista. Hajanainen LC3B-värjäytyminen järjestäytyi uudelleen tuman ympärillä näkyviksi pisteiksi noin 20 nM:n metyleenisinipitoisuudesta alkaen, ja voimakkain LC3-I- ja LC3-II-vaste havaittiin lähellä 1 μM:n pitoisuutta. Sekä LC3B-I että LC3B-II lisääntyivät annos- ja aikariippuvaisesti. Ratkaisevaa oli, että tutkijat etenivät staattista LC3-immunoblottia pidemmälle. He lisäsivät 10 μM klorokiinia, joka estää lysosomaalista hajotusta, ja havaitsivat metyleenisinisellä käsitellyissä soluissa suuremman LC3-II-määrän sekä p62:n stabiloitumisen. Tämä kuvio tukee lysosomeista riippuvaista vaihtuvuutta eikä pelkkää kertymistä. He osoittivat myös, että klorokiini kumosi osittain apoptoosia estävän vaikutuksen, mikä kytkee suojan tässä mallissa autofagia- ja lysosomireittiin.

Signalointitulos on se osa, jota lainataan useimmiten väärin. AMPK-signalointi, jota arvioitiin fosforyloituneen AMPK:n ja sen alavirran kohteen, fosforyloituneen ACC:n, avulla, lisääntyi annosriippuvaisesti 12 ja 24 tunnin kohdalla. AMPK:n estäjä Compound C, jota käytettiin 20 μM:n pitoisuutena viimeisten 4 tunnin ajan, vähensi sekä ACC:n fosforylaatiota että LC3:n aktivaatiota. Fosforyloituneessa mTOR:ssa ei sen sijaan havaittu vaimentumista. Stressatuissa hippokampussoluissa löydös oli siis AMPK:hon liittyvä induktio ilmeisesti mTOR:sta riippumattoman reitin kautta. Sama kuvio havaittiin elävissä hiirissä, joissa metyleenisinikäsittely indusoi makroautofagian markkereita aivokuorella ja hippokampuksessa.

Induktio ei tarkoita loppuun etenevää autofagiavuota

Tässä käsitteiden erottaminen on erityisen tärkeää. Induktio tarkoittaa, että prosessin alkuvaiheen koneisto tuottaa enemmän autofagosomeja. Autofagiavuo tarkoittaa, että hajotettava materiaali kulkee koko reitin: eristäminen, kypsyminen, fuusio lysosomin kanssa, hajotus ja kierrätys. Jokainen LC3-II:n lisääntyminen kertoo induktiosta vasta siihen asti, kunnes autofagiavuota mittaava testi vahvistaa reitin loppuosan.

Tavanomainen autofagiavuotesti mittaa LC3-II:ta sekä lyhyen lysosomaalisen eston, kuten bafilomysiini A1:n tai klorokiinin, kanssa että ilman sitä. Jos käsittely todella nopeuttaa tuotantoa, hajotuksen estämisen pitäisi suurentaa LC3-II-määrää entisestään. Tandem-mCherry-GFP-LC3-reportteri tuo toisen näkökulman: rakenteet fluoresoivat keltaisina ennen fuusiota lysosomin kanssa ja pelkästään punaisina sen jälkeen, kun happamuus sammuttaa GFP-signaalin. Siksi pelkästään punaisten pisteiden lisääntyminen tukee etenemistä happamiin autolysosomeihin. p62-proteiinin väheneminen voi vahvistaa näyttöä hajotettavan materiaalin vaihtuvuudesta. On kuitenkin huomioitava, että myös p62:n transkriptio reagoi stressiin ja se tulisi tarkistaa mRNA-tasolla.

Alla oleva tarkistuslista yhdistää kunkin tässä kirjallisuudessa käytetyn määrityksen siihen, mitä se mittaa ja mitä se ei yksin voi osoittaa. Lukijat voivat käyttää sitä minkä tahansa myöhemmän makroautofagiaväitteen arviointiin, myös sellaisten paastoa ja pitkäikäisyyttä koskevien perustelujen kohdalla, jotka tukeutuvat näihin markkereihin.

Huomaa yksi sanamuotoihin liittyvä ansa, jolta taulukko suojaa. Fosforyloitunut ACC on entsymaattisesti estetty muoto. Sen lisääntyminen osoittaa AMPK:n välittämän vasteen, ei ACC:n aktivaatiota.

Ilmaus ”makroautofagian esto poisti hermosoluja suojaavan vaikutuksen” vaatii samaa täsmällisyyttä. HT22-mallissa se tarkoittaa, että autofagia- ja lysosomireitin häirintä poisti metyleenisinisen tuoman eloonjäämisedun seerumin puuttuessa. Se tukee autofagian välttämätöntä tai myötävaikuttavaa roolia kyseisessä soluviljelmässä. Se ei osoita autofagiaa yhdisteen ainoaksi suojaavaksi mekanismiksi eikä todista klorokiinin vaikuttavan yksinomaan autofagian kautta. Syy-yhteyttä koskevan väitteen vahvistaminen edellyttäisi ATG5:n, ATG7:n tai ULK1:n toiminnan geneettistä muuttamista.

Kaksi reittiä samaan koneistoon

Yksinkertaistettu kaavio auttaa. Energiastressi lisää AMPK:n aktiivisuutta, AMPK aktivoi ULK1-kompleksin ja autofagia käynnistyy. Kasvutekijät ja ravintoaineet lisäävät mTORC1:n aktiivisuutta, mTORC1 estää ULK1:tä ja autofagia pysyy sammuksissa. ULK1:n alavirran vaiheissa Beclin-1:n ja VPS34:n muodostama kompleksi käynnistää fagoforin muodostumisen, LC3-I lipidoidaan LC3-II:ksi, autofagosomi sulkeutuu ja fuusioituu lysosomin kanssa, ja materiaali hajotetaan samalla kun p62:n vaihtuvuus jatkuu.

Kaavio sijoittaa kunkin metyleenisinilöydöksen tälle kartalle: hippokampussolujen tuloksen AMPK-haaran viereen ja esiastesolujen tuloksen mTOR-haaran viereen.

Tämä jäsennys selittää näennäisen ristiriidan Xien toisen tutkimuksen kanssa. Jakautuvissa rotan hermosolujen esiastesoluissa erillisessä kokeessa havaittiin, että 5 μM metyleenisinistä esti solujen lisääntymistä ja edisti lepotilaa. Ki67-positiivisten solujen määrä väheni päivinä 1 ja 3, mutta hermosolulinjaan sitoutuneiden solujen erilaistuminen säilyi ennallaan. Tässä mekanismi kulki vaimentuneen mTOR-signaloinnin kautta: mTOR:n kokonaismäärä ja fosforyloitunut mTOR vähenivät yhdessä p70S6K:n ja 4EBP1:n vähentyneen ilmentymisen sekä sykliinien E1, B1, D1 ja D2 ilmentymisen vaimentumisen kanssa. Vallitseva fenotyyppi oli esiastesolujen lepotila, jonka kirjoittajat yhdistivät solujen vanhenemisen viivästymiseen, ei stressattujen hippokampussolujen pelastumiseen.

Näiden kahden artikkelin välillä ei ole ristiriitaa. AMPK ja mTOR ovat olosuhteisiin reagoivia signaalien yhdistäjiä, eivät kiinteitä kytkimiä. Stressattu, hermosolun kaltainen solu voi aktivoida AMPK:n ilman mitattavaa mTOR:n estoa, kun taas mitogeenien ohjaama esiastesolu voi reagoida samaan yhdisteeseen hillitsemällä mTOR:sta riippuvaista kasvukoneistoa. Solutyyppi, stressin luonne, pitoisuus ja ajankohta ratkaisevat, kumpi haara hallitsee. Siksi myös metyleenisinisen vaikutukset mitokondrioiden energiantuotantoon ja hapetus-pelkistystasapainoon kuuluvat samaan kokonaisuuteen: kuten hermosoluja suojaavia mekanismeja käsittelevä katsaus kuvaa, yhdiste toimii vaihtoehtoisena elektroninkuljettajana, aktivoi antioksidatiivista ja apoptoosia estävää signalointia, estää MAO:ta ja NOS:ää sekä kytkeytyy mitokondrioiden uudistumiseen biogeneesin ja autofagian kautta. Autofagia on yksi haara monivaikutteisessa profiilissa, ei koko selitys.

Mitä kokeet eivät osoita

Seerumin poistaminen mallintaa troofista ja aineenvaihdunnallista stressiä soluviljelmässä. Se ei mallinna koko elimistön paastoa: glukoosi, aminohapot ja suolat jäävät peruselatusaineeseen, eikä ruokailukäyttäytymistä ole. Viljelmien pitoisuuksia 20 nM:stä 5 μM:iin ei voi muuntaa ihmisten annoksiksi laskutoimituksella, koska imeytyminen, proteiineihin sitoutuminen, hapetus-pelkistystila, aineenvaihdunta, kudoksiin kertyminen ja altistusaika poikkeavat toisistaan.

Yhtäkään ihmistutkimusta ei ole suunniteltu osoittamaan metyleenisinisen indusoimaa autofagiavuota potilailla. Mekanistinen näyttö perustuu edelleen solu-, ex vivo- ja eläintutkimuksiin, ja katsauksissa näyttöä tulosten sovellettavuudesta ihmisiin kuvataan yhä alustavaksi. Nämä tutkimukset eivät siis osoita, että metyleenisininen jäljittelisi paastoa, pidentäisi ihmisen elinikää autofagian kautta tai saisi autofagiavuon etenemään loppuun ihmisen aivoissa. Paastoa jäljittelevät vaikutukset ja pitkäikäisyysväitteet tarvitsevat oman kliinisen näyttönsä, eivätkä metyleenisinisen ihmistutkimukset muissa käyttöaiheissa muutu autofagiatutkimuksiksi pelkän yhteyden perusteella. Ravintoaineiden puutteesta johtuvaa stressiä ja pitkäikäisyysmalleja koskevia tutkimuksia on luettava tämä raja mielessä pitäen.

Kun luet seuraavan tutkimusartikkelin, käy tarkistuslista läpi järjestyksessä. Kysy ensin, missä haarassa tapahtui muutos: AMPK:ssa, mTOR:ssa vai ei kummassakaan. Kysy sitten, yhdistettiinkö LC3-tulokseen autofagiavuotesti vai jäikö se yksittäiseksi havainnoksi. Tarkista seuraavaksi, poistiko reitin estäminen hyödyn ja millä menetelmällä esto tehtiin. Tutkimus, joka vastaa kaikkiin kolmeen kysymykseen, antaa perustan vahvalle mekanistiselle väitteelle. Tutkimus, joka vastaa vain ensimmäiseen, on osoittanut lupasignaalin, ja reitin loppuosa jää kartoittamatta.