Metyleenisininen ja aivojen tukisolut: astrosyytit, mikroglia ja tulehdus

Oletetaan, että teet samalla sinisellä väriaineella kaksi koetta ja saat kaksi rohkaisevaa tulosta. Yhdessä maljassa tähdenmuotoiset tukisolut selviävät hapen ja glukoosin puutteesta. Toisessa aivojen immuunisolut säilyttävät rauhallisen, haaroittuneen muotonsa bakteeritoksiinista huolimatta. On houkuttelevaa yhdistää tulokset yhdeksi väitteeksi: väriaine rauhoittaa aivojen tulehdusta ja suojaa aivoja. Juuri tässä yhdistämisen kohdassa huolellisen lukijan kannattaa hidastaa.

Aivoissa on kaksi tukisolupopulaatiota, joilla on eri tehtävät, ja metyleenisinistä tutkitaan kummassakin eri kokeellisen ärsykkeen yhteydessä. Astrosyytit ovat aineenvaihduntaa tukevia soluja. Ne sijaitsevat verisuonten ja hermosolujen välissä, poistavat ylimääräistä glutamaattia, puskuroivat kaliumia, varastoivat glykogeenia ja kuljettavat hermosoluille polttoainetta tarpeen kasvaessa äkillisesti. Mikrogliasolut ovat aivojen paikallisia immuunivalvojia. Niiden ohuet ulokkeet tarkkailevat kudosta ja havaitsevat bakteeri- ja vauriosignaaleja. Hälytyksen tullessa ulokkeet vetäytyvät ja solut muuttuvat pyöristyneeseen, amebamaiseen muotoon, joka soveltuu liikkumiseen ja materiaalin nielemiseen, samalla kun ne vapauttavat signalointimolekyylejä. Yhdessä solupopulaatiossa saatu tulos ei siirry toiseen, ja kussakin tapauksessa käytetty mittaus määrittää, mitä todella osoitettiin.

Astrosyytit metabolisessa stressissä: ajoitus on keskeinen tulos

Astrosyyttikoe alkaa puutostilasta. Tutkijat viljelivät vastasyntyneiden hiirten aivokuoren astrosyyttejä, poistivat glukoosin ja lähes kaiken hapen kuudeksi tunniksi ja palauttivat sitten molemmat kahdeksikymmeneksineljäksi tunniksi. Kyseessä on laboratoriomalli aivohalvauksesta ja sitä seuraavasta reperfuusiosta. Kun metyleenisinistä oli läsnä puutosvaiheen aikana, solujen eloonjääminen heikkeni. Kun sitä lisättiin vasta hapen palauttamisen vaiheessa pitoisuuksilla 0.1 ja 1 mikromolaarinen, eloonjääminen parani merkitsevästi kalseiiniin perustuvalla elinkykytestillä mitattuna. Hiiren astrosyyttejä koskeva tutkimus raportoi tämän ajoituksesta riippuvan eron yhdessä soluhengitystä koskevien tietojen kanssa.

Tämä ero on tärkein havainto. Puutosvaiheessa happea ei juuri ole vastaanottamassa elektroneja, joten elektronien välittäjällä ei ole paikkaa, johon ne toimittaa. Hapen palautuessa koneisto käynnistyy uudelleen ja väriaineelle löytyy tehtävä. Käsitellyt astrosyytit kuluttivat enemmän happea, ottivat enemmän glukoosia, tuottivat enemmän ATP:tä ja täydensivät glykogeenivarastojaan. Heksokinaasin aktiivisuus kasvoi, mutta mitokondrioiden superoksidin määrä ei lisääntynyt. Ehdotettu selitys on sama kuin kuvauksessa metyleenisinisestä mitokondrioiden elektroninkuljettajana: se kuljettaa elektroneja hengitysketjun tukkeutuneiden kohtien ohi, jolloin soluhengitys käynnistyy uudelleen hallitusti sen sijaan, että elektroneja vuotaisi reaktiivisten yhdisteiden muodostumiseen.

Huomaa, millaisesta näytöstä on kyse. Tulos koskee eloonjäämistä ja aineenvaihduntaa yhdessä eristetyssä solutyypissä, ja sille on määritelty vaikutuksen aikaväli eli toipuminen, ei puutosvaihe, sekä pitoisuusalue. Se ei kerro mitään immuunisignaloinnista eikä käyttäytymisestä.

Mikroglia bakteerihälytyksessä: aineenvaihdunnan uudelleenohjelmointi

Mikrogliakokeet alkavat päinvastaisesta ärsykkeestä: ravinnon puutteen sijaan kyseessä on väärä infektiohälytys. Lipopolysakkaridi, bakteerin ulkokalvon osa, sitoutuu synnynnäisen immuunijärjestelmän tunnistimiin ja saa mikrogliasolut tulkitsemaan, että taudinaiheuttajia on saapunut, vaikka eläviä bakteereja ei ole läsnä. Lipopolysakkaridia saaneissa hiirissä ja viljellyssä mikrogliasolulinjassa seurauksena on tuttu tulehdusohjelma: tulehdusta edistävien tekijöiden määrät kasvavat, mikrogliasolut polarisoituvat kohti aggressiivista M1-tilaa, viereiset hermosolut kuolevat ja eläimet suoriutuvat huonommin oppimis- ja muistitehtävistä.

Tätä vastetta koskeva hiiritutkimus jäljittää sen happea aistivaan signalointireittiin: lipopolysakkaridi lisää PHD3:n, yhden kolmesta prolyylihydroksylaasientsyymistä, ilmentymistä reitin aiemmassa vaiheessa toimivan Siah2/Morg1-ketjun kautta. Samalla solut ohjelmoivat energiankäyttönsä uudelleen kohti aerobista glykolyysiä ja mitokondrioiden reaktiivisten happiyhdisteiden määrä kasvaa. Tutkijat mittasivat tämän muutoksen suoraan Seahorse-aineenvaihduntamäärityksillä, jotka mittaavat hapenkulutusta ja solunulkoisen ympäristön happamoitumista. Metyleenisininen kumosi sekä aineenvaihdunnan muutoksen että PHD3:n yli-ilmentymisen, vähensi tulehdustekijöitä ja hermosolukuolemaa sekä paransi käyttäytymistestien tuloksia. Positroniemissiotomografia toi mukaan kuvantamisen: lipopolysakkaridi lisäsi hippokampuksen glukoosinottoa FDG-PET-kuvauksessa, ja käsittely laski sitä jälleen. Tämä sopii yhteen elävien aivojen rauhoittuneen tulehdukseen liittyvän aineenvaihdunnan kanssa.

Tässä mittausvalikoima on laajempi kuin astrosyyttitutkimuksessa: mukana ovat sytokiinit, aineenvaihdunta, kuvantaminen ja eläinten käyttäytyminen. Kyseessä ovat kuitenkin eri ärsyke ja eri solutyyppi. Tutkimuksia vertailevan lukijan kannattaa pitää ärsykkeet erillään: yhdessä tutkimuksessa pelastetaan energianpuutteesta kärsiviä tukisoluja toipumisen aikana, toisessa vaimennetaan immuunisolujen väärää infektiohälytystä.

Mikroglia mikroskoopissa: muoto mittarina

Kolmas koe tarkastelee samaa bakteerihälytystä pelkän muodon kautta. Rotan aivokuoresta peräisin olevissa gliasoluviljelmissä IBA1-merkkiaineella värjätyillä verrokkimikrogliasoluilla näkyy runsaasti ohuita ulokkeita eli haaroittunut, ympäristöä tarkkaileva muoto. Kun solut altistetaan lipopolysakkaridille pitoisuudella 10 mikrogrammaa millilitrassa kahdenkymmenenneljän tunnin ajan, ne litistyvät amebamaiseen muotoon. Solurungon pinta-ala kasvaa, mutta sen ympärysmitta pysyy suunnilleen samana, mikä on pyöristymisen geometrinen tunnusmerkki. Metyleenisininen pitoisuudella 1 mikromolaarinen, samanaikaisesti toksiinin kanssa annettuna, säilytti haaroittuneet ulokkeet ja piti solurungon pinta-alan ja ympärysmitan lähellä verrokkiarvoja. Rotan soluviljelmää koskeva tutkimus mittaa tämän muodon säilymisen solurungon pinta-alan ja ympärysmitan avulla.

Kaksi yksityiskohtaa tekee tästä tutkimuksesta enemmän kuin pelkän kuvan. Ensinnäkään vertailuyhdiste menadioni, toinen redox-aktiivinen molekyyli samalla pitoisuudella, ei säilyttänyt muotoa. Yksinään se myös ohjasi soluja kohti aktivoitunutta muotoa, joten vaikutus ei ole kaikkien redox-kiertoon osallistuvien yhdisteiden yleinen ominaisuus. Toiseksi tutkijat liittävät väriaineen vaikutuksen Nrf2:n aktivoitumiseen eivätkä pelkästään reaktiivisten yhdisteiden suoraan neutralointiin. Nrf2 on transkriptiotekijä, joka ohjaa antioksidatiivisiin ja tulehdusta hillitseviin geeneihin liittyvää ohjelmaa. Redox- ja tulehdussignalointia käsittelevät muut tekstit asettavat tämän Nrf2-yhteyden laajempaan yhteyteen.

Muoto on silti näistä kolmesta mittarista rajallisin. Haaroittunut solu on yleensä ympäristöä tarkkaileva ja pyöristynyt solu yleensä aktivoitunut, mutta morfologia on epäsuora mittari, ei transkriptioprofiili. Tässä viljelmässä ei ollut verenkierrosta peräisin olevia immuunisoluja, hermoverkkoja eikä mitattavaa käyttäytymistä.

Kolmen tuloksen tarkastelu rinnakkain

Rivejä yhdistää se, että kullakin ärsykkeellä on oma mittauksensa ja oma vastauksensa. Aineenvaihdunnan palautuminen vastaa aineenvaihduntaa koskevaan kysymykseen. Sytokiini- ja käyttäytymistiedot vastaavat tulehdusta koskevaan kysymykseen. Muoto vastaa muotoa koskevaan kysymykseen. Mikään näistä kolmesta ei yksin ulotu muihin.

Mitä rauhallisemmalta näyttävä mikroglia ei todista

Koko aihe tarvitsee tämän lauseen: vähemmän aktivoituneelta näyttävä mikroglia tai mikrogliasolujen muuttunut aineenvaihdunta ei yksin todista aivotoiminnan parantuneen.

Morfologia voi muuttua ilman vastaavaa muutosta toiminnassa. Solu voi säilyttää haaransa ja silti vapauttaa sytokiineja, tai se voi pyöristyä poistaessaan hyödyllisesti solujätettä. Aineenvaihduntamittauksilla on sama rajoitus: Seahorse-mittauskäyrä tai PET-kuva näyttää energiankäsittelyä, ei kognitiota. Hiiritutkimus, jossa aineenvaihduntaa ja morfologian kaltaisia ominaisuuksia kuvaavat mittaukset yhdistettiin käyttäytymistesteihin, on vahvempi juuri siksi, että siinä koottiin useita näytön tasoja sen sijaan, että johtopäätös olisi jätetty yhden mittauksen varaan. Siinäkin pätevät tavalliset rajoitukset: lipopolysakkaridi mallintaa steriiliä hälytystä eikä todellista infektiota, hiiret eivät ole ihmisiä, ja tutkijat itsekin nostavat esiin lajien väliset erot. Jatkotutkimuksia suunnittelevan tulee punnita, miten mikrogliaa koskevat havainnot siirtyvät mallista toiseen, ennen kuin olettaa signalointireitin toimivan samalla tavalla ihmiskudoksessa.

Tästä seuraa ajoitukseen liittyvä käytännön huomio. Astrosyyttitutkimuksessa varhainen annostelu heikentää tulosta ja toipumisen aikainen annostelu parantaa sitä. Mikrogliatulokset perustuvat annosteluun tulehdusärsykkeen ajankohdan ympärillä. Todellisessa aivovauriossa molemmat vaiheet esiintyvät rinnakkain: energiantuotannon häiriö ja immuunihälytys kehittyvät tuntien kuluessa. Koe, jossa eristetään yksi vaihe, ei voi määrittää aikataulua yhdistetylle tilanteelle. Siksi annostelun aikaikkunoita käsittelevissä tarkasteluissa puutosvaiheen ja tulehduksen aikajanat pidetään erillään.

Rehellinen yhteenveto mahtuu yhteen kappaleeseen. Eristetyissä astrosyyteissä hapen palauttamisen aikana annettu metyleenisininen käynnistää soluhengityksen uudelleen ja pelastaa soluja. Bakteerin osalla stimuloidussa mikrogliassa se kumoaa tulehduksellisen aineenvaihduntaohjelman tietyn PHD3-reitin kautta ja säilyttää lepotilaisen muodon. Kukin tulos on todellinen omassa koeasetelmassaan, eikä kumpikaan ole yleinen päätelmä aivojen tulehduksesta. Gliasolujen vertailu on hyödyllinen juuri siksi, että se estää näitä kahta kertomusta sulautumasta yhdeksi.