Metyleenisininen anaerobisuuden ja hapen indikaattorina: mitä värinmuutos osoittaa

Laborantti sulkee anaerobipurkin, tarkistaa metyleenisininen-indikaattoriliuskan kannen läpi ja näkee sen, mitä haluaakin nähdä. Liuska on muuttunut sinisestä valkoiseksi. Hän kirjaa koeajon anaerobiseksi ja jatkaa työtään. Kaksi päivää myöhemmin yhdellä maljalla ei kasva mitään, mutta saman purkin sisällä olevassa suljetussa liemiviljelyputkessa näkyy merkkejä hapelle altistumisesta. Liuska kertoi totuuden. Laborantti esitti sille väärän kysymyksen.

Sekaannus johtuu käsitteiden sekoittumisesta. Metyleenisininen anaerobisuuden indikaattorina liittyy redox-olosuhteisiin, ei steriiliyteen eikä koko järjestelmän validointiin. Kun tämä ero on selvä, liuskasta tulee tarkka ja luotettava väline, jolla on rajattu tehtävä.

Periaate: palautuva redox-pari

Liuennut metyleenisininen esiintyy kahdessa muodossa. Hapettunut muoto on tuttu sininen kationi. Pelkistynyt muoto, leukometyleenisininen, on väritön. Lähellä neutraalia pH:ta yksinkertaistetussa puolireaktiossa yksi sininen kationi, yksi protoni ja kaksi elektronia muodostavat yhden värittömän leukomolekyylin. Formaalipotentiaali on noin plus 11 millivolttia standardivetyelektrodiin nähden pH:ssa 7. Se on siis alueella, jonka monet pelkistävät järjestelmät voivat saavuttaa ja jossa happi voi kääntää reaktion suunnan.

Pelkistyminen vaatii matalan paikallisen redox-potentiaalin. Pelkkä hapen poistaminen ei aina riitä. Varhaisissa anaerobisuutta koskevissa tutkimuksissa havaittiin, että metyleenisininen säilytti värinsä pelkässä hapettomassa vedessä, ellei mukana ollut pelkistävää ainetta. Lisäksi glukoosiliemen ja noin 0.01 prosentin väriainemäärän seokset menettivät värinsä helposti lämpötilassa 37 C, kun taas sama seos säilyi sinisenä vuorokauden ajan lämpötilassa 4 C. Havainnot raportoitiin tuoretta kudosta ja anaerobisia viljelyolosuhteita koskevissa kokeissa. Lämpötila, pH, glukoosi, askorbaatti, tioglykolaatti ja mikrobien pelkistävä toiminta vaikuttavat kaikki siihen, ovatko elektronit käytettävissä.

Uudelleenhapettumiseen tarvitaan vain happea. Kun ilma pääsee kosketuksiin leukomuodon kanssa, se muuttuu takaisin siniseksi. Nykyaikaiset tarkoitukseen kehitetyt indikaattorit hyödyntävät juuri tätä kiertoa: väriaine, pelkistin ja stabiloiva matriisi tuottavat indikaattorin, joka on väritön vähähappisissa oloissa ja muuttuu jälleen siniseksi altistuessaan ilmalle. Tämä osoitettiin väriaineeseen, pelkistimeen, pinta-aktiiviseen aineeseen ja saveen perustuvalla metyleenisininen-happihybridi-indikaattorilla. Prototyypissä käytettiin 0.01 millimolaarista väriainetta ja 2.0 millimolaarista askorbaattia tai glukoosia pH:ssa 11. Se muuttui värittömäksi happipitoisuuden ollessa noin 0.5 tilavuusprosenttia ja erotti koekammiossa alle 0.1 prosentin happipitoisuuden yli 0.5 prosentin happipitoisuudesta.

Toimintaperiaate on siis yksinkertainen. Sininen tarkoittaa, että indikaattorialue on hapettunut. Väritön tarkoittaa, että indikaattorialueella on saavutettu pelkistävät, vähähappiset olosuhteet. Muutos on palautuva, paikallinen ja kemiallinen. Se ei itsessään kerro mitään mikrobeista.

Miten metyleenisininen-indikaattoriliuska toimii anaerobipurkissa

Anaerobipurkin metyleenisininen-indikaattoriliuska on pieni reaktioalue, joka sijoitetaan purkin kaasutilaan niin, että se näkyy astiaa avaamatta. Kaupallisia tuotteita on erilaisia: paperiliuskoja, käyttöönoton yhteydessä liuotettavia tai kostutettavia tabletteja sekä uudempia hybridipapereita. Joissakin reaktioalue aktivoidaan yhdellä pisaralla tislattua vettä. Toiset ovat kuivana käytettäviä tuotteita, joiden on pysyttävä kuivina. Kyseisen tuotteen käyttöohjetta on noudatettava, koska kostutus, sijoittelu ja lukuaika ovat osa kemiallista toimintaa.

Käytännössä tulkinta on kaksijakoinen. Sininen tarkoittaa, että liuskan kohdalla on edelleen happea tai olosuhteet eivät ole riittävän pelkistävät. Valkoinen tai väritön tarkoittaa, että liuskan kohdalla on saavutettu anaerobiset redox-olosuhteet. Joissakin kaupallisissa indikaattoripapereissa on punainen taustapigmentti, joten pelkistynyt lopputila näkyy vaaleanpunaisena eikä valkoisena. Selvitä ennen arviointia, millaisen lopputilan tuotteesi ilmoittaa.

Aikataulu vaihtelee järjestelmän mukaan. Eräässä GasPak-tyyppisessä järjestelyssä väri alkoi haalistua noin tunnin kuluessa ja katosi kokonaan muutamassa tunnissa, kun taas kontrolloidussa vertailussa huoneenlämmössä metyleenisininen tarvitsi yli kuusi tuntia. Viljelyalustan redox-potentiaali saavutti kyseisessä tutkimuksessa noin miinus 100 millivolttia 60–100 minuutissa, selvästi ennen värinmuutoksen päättymistä. Kun liuska oli muuttunut täysin värittömäksi, potentiaali oli jo selvästi alle miinus 200 millivoltin. Indikaattori reagoi kaasutilan muutokseen viiveellä. Sininen liuska yhden tunnin kohdalla ei osoita epäonnistumista, ja valkoinen liuska kuuden tunnin kohdalla kuvaa liuskan tilaa kuuden tunnin kohdalla.

Sijoittelu on tärkeää samasta syystä. Pidä liuska kaasutilassa, näkyvissä kannen läpi ja erillään agarpinnoista ja viljelyalustoista. Se kertoo välittömän ympäristönsä olosuhteista. Jos asetat sen tiiviisti kylmää seinämää vasten, hautaat sen maljojen alle tai annat kondenssiveden kastella sen, se kertoo kyseisestä mikroympäristöstä eikä purkin olosuhteista.

Mitä liuska kertoo ja mitä se ei kerro

Ajattele anaerobipurkin metyleenisininen-indikaattoria yhtenä anturina yhdessä paikassa. Se osoittaa paikalliset redox- ja happiolosuhteet omalla reaktioalueellaan. Ne edustavat pääpiirteissään kaasutilaa, jos sekoittuminen ja tasapainottuminen ovat riittäviä. Kaikki tätä pidemmälle menevä on päättelyä, ja päättely tarvitsee erillistä näyttöä.

Väritön liuska ei osoita steriiliyttä. Steriiliys tarkoittaa elinkykyisten organismien puuttumista, ja se osoitetaan validoidulla steriloinnilla ja viljelyn validointikontrolleilla. Purkki voi olla täysin anaerobinen ja silti kontaminoitunut tai täysin steriili ja silti aerobinen.

Liuska ei validoi viljelyjärjestelmän jokaista osaa. Suljetun putken sisällä oleva liuennut happi, syvälle agariin jäänyt happi, täyteen pakatun purkin pitoisuusgradientit ja lukemisen jälkeen syntyvä vuoto jäävät kaikki yhden liuskan havaitsematta. Tilallisia eroja selvittäneissä kokeissa samassa astiassa havaittiin vierekkäisiä sinisiä ja värittömiä alueita, joissa hapen tunkeutuminen ja pelkistävä toiminta tasapainottuivat eri tavoin. Yksi mittauspiste ei voi varmentaa koko tilavuutta.

Liuska ei osoita, että anaerobisuus on säilynyt keskeytyksettä. Käyttöönoton yhteydessä kerran luettu liuska ei kerro mitään kahdenkymmenen tunnin kohdalla vallitsevista oloista. Viimeaikaisessa anaerobisten olosuhteiden laadunvarmistustyössä varoitetaan, että kemialliset indikaattorit kuvaavat kaasutilaa lukuhetkellä ja voivat näyttää hyväksyttäviltä pienestä jäännöshappimäärästä huolimatta. Liuskan havainnot yhdistää inkubointiin jatkuva tai tarkistuspisteissä tehtävä dokumentointi, ei yksi vilkaisu lopputilaan.

Värinmuutoksen taustalla olevasta kemiasta voit lukea artikkelista miten metyleenisininen kiertää hapettuneen ja pelkistyneen muodon välillä. Hapen laajempaa vaikutusta näytteiden käsittelyyn käsitellään mikroskopia- ja viljelytyön hapenhallinnassa.

Kaavio purkin viereen

Alla oleva kuva tiivistää artikkelin työpisteessä käytettäväksi muistilistaksi. Siinä esitetään saman liuskan kolme tilaa, reaktion kaksi suuntaa sekä indikaattorin antaman näytön ja järjestelmän validoinnin välinen raja.

Virhetilanteet, jotka pitävät liuskan sinisenä tai antavat väärän turvallisuudentunteen

Useimmat virhetilanteet jakautuvat viiteen ryhmään. Jokaisella on omat tunnusmerkkinsä.

Vuotava purkki tai pussi syöttää jatkuvasti happea reaktioalueelle. Liuska pysyy sinisenä tai muuttuu haalistumisen jälkeen uudelleen siniseksi. Tarkista kansi, tiiviste, kiinnittimet ja tiivistyspinnat ennen kuin epäilet kemiaa.

Loppuun kulunut tai väärin aktivoitu kaasunkehitin ei poista happea lainkaan. Vanhemmissa vedellä aktivoitavissa järjestelmissä kondenssiveden puuttuminen noin 10–15 minuutin kohdalla ja kannen lämpenemisen puuttuminen noin 20–40 minuutin kohdalla olivat kyseisen järjestelmän varhaisia varoitusmerkkejä. Liian pieni pussi liian täydessä purkissa epäonnistuu samalla tavoin.

Katalyytin myrkyttyminen koskee vain vanhempia vetyä ja palladiumia käyttäviä järjestelmiä, joissa palladium saa vedyn ja hapen yhdistymään vedeksi. Kosteus ja rikkivety heikentävät sen toimintaa. Monet nykyiset pussit eivät käytä palladiumia lainkaan, joten älä sovella tätä korjaustoimenpidettä järjestelmään, johon se ei kuulu.

Vaurioitunut tai väärin käsitelty liuska voi pettää huomaamatta. Väriaineen ja pelkistimen reaktioiden palautuvuus heikkenee varastoinnissa. Tämä on yksi syy siihen, että hybridikoostumuksia kehitettiin kestämään valon aiheuttamaa haalistumista ja varastoinnin aikaista toiminnan heikkenemistä. Hylkää vanhentuneet tuotteet, tuotteet, joiden lähtöväri on poikkeava, sekä liuskat, jotka on kasteltu, vaikka niiden pitäisi olla kuivia, tai jätetty kuiviksi, vaikka ne vaativat kostutusta.

Gradientti tai viive johtaa lukijaa harhaan, vaikka kemia toimisi oikein. Huonosti sekoittunut kaasutila, liuennutta happea sisältävät suljetut putket ja puolikiinteät viljelyalustat säilyttävät kukin omat olosuhteensa pidempään kuin liuska antaa ymmärtää. Resatsuriiniliuskat muuttuvat vaaleanpunaisen kautta värittömiksi, ja niitä markkinoidaan usein nopeampina. Niiden kynnysarvot ovat kuitenkin koostumuskohtaisia eikä niitä voi soveltaa metyleenisiniseen.

Kontrollit ja lukuprotokolla, jotka kannattaa ottaa käyttöön

Kaksi edullista kontrollia paljastaa useimmat virhetulkinnat. Pidä tuoretta ilmakontrolliliuskaa huoneilmassa koeajon rinnalla. Toimiva metyleenisininen-liuska pysyy siinä sinisenä. Jotkin pakatut indikaattorit ovat aluksi vaaleita ja muuttuvat sinisiksi avattaessa, mikä on jo itsessään toiminnan tarkistus. Aseta lisäksi säännöllisesti tuore liuska aiemmin validoituun anaerobiseen järjestelyyn. Sen pitäisi saavuttaa validoitu pelkistynyt lopputila tuotteelle määritetyssä ajassa. Jos jompikumpi kontrolli toimii poikkeavasti, vaihda tuote-erä ennen kuin luotat purkin lukemiin.

Lukuprotokolla perustuu toimintamekanismiin. Sijoita liuska kaasutilaan niin, että se näkyy purkkia avaamatta, ja noudata tuoteohjeen määräyksiä seinämäkosketuksesta ja kostutuksesta. Kirjaa lähtöväri, purkin sulkemisaika ja väri tuotteelle määritetyssä tarkistuspisteessä. Jos astia mahdollistaa sen, kirjaa määritetyissä tarkistuspisteissä inkuboinnin aikana, että indikaattori on pysynyt pelkistyneenä. Kirjaa lopullinen väri välittömästi ennen avaamista. Tämä ennen avaamista havaittu väri on kyseisen koeajon lopputulos. Avaamisen jälkeen liuskan odotetaan muuttuvan uudelleen siniseksi, eikä tämän pidä muuttaa aiempien havaintojen tulkintaa.

Jos liuska pysyy sinisenä määritetyn ajan jälkeen, pidä anaerobisuutta varmentamattomana. Käy ketju läpi järjestyksessä: tiiviys, pussi, mahdollinen katalyytti, indikaattorin kostutus ja viimeinen käyttöpäivä sekä lopuksi indikaattorin toiminta ilmakontrolliin verrattuna. Kasvua tai kasvun puuttumista tulee tulkita vasta, kun kaasutilan olosuhteet on varmennettu, käyttäen käyttötarkoitukseen sopivaa anaerobista viljelyjärjestelyä ja organismikontrolleja.

Liuskalla on viimeinen sana omalla toiminta-alueellaan. Sinisenä tai värittömänä se vastaa yhteen kysymykseen yhdestä paikasta yhtenä ajankohtana. Kun esität tämän kysymyksen aikataulun mukaisesti ja käytät rinnalla kontrolleja, vastaus on luotettava. Jos kysyt steriiliydestä, jokaisesta putkesta tai koko inkuboinnista yhden vilkaisun perusteella, mikään indikaattorikemia ei voi pelastaa tulkintaa.