Loefflerin emäksinen ja polykrominen metyleenisinivärjäys selitettynä

Värjäyspöydällä voi olla vierekkäin kolme pulloa, joiden kaikkien etiketissä mainitaan jokin metyleenisinisen muoto. Yhdessä lukee metyleenisinisen vesiliuos 1%. Toisessa lukee Loefflerin emäksinen metyleenisininen. Kolmannessa lukee polykrominen metyleenisininen. Kiireinen työntekijä tarttuu lähimpään pulloon. Sivelyvalmiste värjäytyy sitten liian heikosti, liian tasaisesti siniseksi tai odottamattomiin violetin sävyihin, ja tuloksesta syytetään näytettä.

Ongelma on liuoksen koostumuksessa, ei näytteessä. Nämä kolme liuosta sisältävät sukulaisväriaineita, mutta perustuvat erilaisiin värjäysperiaatteisiin. Yksi on yksinkertainen kationinen väriaine lähes neutraalissa pH:ssa. Toinen on sama väriaine, jonka värjäysvoimaa emäs vahvistaa. Kolmas ei enää ole yksittäinen väriaine lainkaan, vaan tarkoituksella hapetettu seos. Väärän liuoksen käyttö muuttaa värjäysperiaatteen kesken työn.

Lyhyt vastaus

Tavallinen metyleenisinisen vesiliuos on vertailukohta: noin 1% väriainetta vedessä, yksinkertainen kationinen värjäysliuos bakteerien morfologian tarkasteluun ja yleiseen mikroskopiaan. Loefflerin emäksisessä metyleenisinisessä veteen laimennettuun alkoholipohjaiseen kantaliuokseen lisätään pieni, tarkasti mitattu määrä laimeaa emästä. Tämä nostaa pH:ta ja tehostaa kationisen väriaineen sitoutumista bakteerien happamiin rakenteisiin. Polykrominen metyleenisininen on metyleenisinistä, jota on tarkoituksella kypsytetty hapettamalla emäksisessä ympäristössä. Pullossa on siis jäljellä olevan metyleenisinisen lisäksi demetyloituneiden homologien (azure A, azure B, azure C), tioniinin ja metyleenivioletin seos, joka värjää eri rakenteet eri sävyihin.

Jos muistat vain yhden lauseen: emäksiseksi muuttaminen vaikuttaa värjäyksen voimakkuuteen, kun taas polykromisointi muuttaa värjäyksen värejä.

Tavallinen metyleenisinisen vesiliuos: vertailukohta

Yksinkertaisin koostumus on veteen liuotettu metyleenisininen, tavallisesti pitoisuudeltaan 1% w/v, ilman emästä ja ilman hapetusta. Värillinen muoto on metyylitioniniumkationi, jonka vastaioni on kloridi. Se on pieni, tasomainen fenotiatsiiniväriaine, joka kuvataan PubChemin metyleenisinisen tietueessa metyylitioniniumkloridiksi. Kationina se sitoutuu nukleiinihappojen fosfaattirunkoihin ja bakteerien soluseinien happamiin ryhmiin ja värjää solut sinisiksi vaaleaa taustaa vasten.

Sen vahvuus on ennustettavuus. Tumat ja bakteerit näkyvät sinisinä. Kontrasti on kohtalainen. Heikosti erottuvat mikrobit voivat värjäytyä heikosti, ja juuri tämän rajoituksen Loeffler pyrki korjaamaan. Laajempaa yksinkertaisten bakteerivärjäysten ryhmää, johon tämä liuos kuuluu, käsitellään bakteerien yksinkertaisen värjäyksen yleiskatsauksessa. Myös tässä aineen täsmällinen tunnistaminen on tärkeää: metyylisininen on täysin eri molekyyli, kuten artikkeli metyylisinisen ja metyleenisinisen eroista selittää. Pelkkään värin nimeen perustuva tuoteluettelohaku voi siis johtaa väärään väriaineluokkaan.

Loefflerin emäksinen metyleenisininen: sama väriaine, tehokkaampi värjäys

Klassinen Loefflerin resepti yhdistää metyleenisinisen alkoholipohjaisen kantaliuoksen laimeaan emäksen vesiliuokseen. Oppikirjaversioissa käytetään 0.3 g väriainetta liuotettuna 30 mL:aan 95% etanolia sekä 100 mL 0.01% kaliumhydroksidin vesiliuosta. Vaihtoehtoisesti käytetään 30 mL kyllästettyä metyleenisinisen alkoholiliuosta, 100 mL tislattua vettä ja 1 mL 1% KOH-liuosta. Näin saadaan selvästi emäksinen käyttöliuos, jonka väriainepitoisuus on noin 0.3%. Kaupalliset versiot noudattavat samaa periaatetta, ja Thermo Fisherin mikrobiologisten värjäysaineiden tuoteluettelo esittelee Loefflerin emäksisen metyleenisinisen sekä polykromiset ja vesiliuosmuotoiset vaihtoehdot erillisinä tuotteina, joilla on eri käyttötarkoitukset.

Keskeinen tekijä on emäs. pH:n nostaminen deprotonoi näytteen karboksyyli- ja fosfaattiryhmiä ja lisää negatiivisten sitoutumiskohtien tiheyttä. Alkoholipohjainen kantaliuos puolestaan pitää väriaineen täysin liuenneena, jotta se pääsee näihin kohtiin monomeerimuodossa. Tulos on nopeampi ja voimakkaampi bakteerien värjäytyminen kuin neutraalilla vesiliuoksella: tavallisessa bakteriologisessa sivelyvalmisteessa nähdään tutut syvänsiniset sauvat ja kokit. Värjäysaika on tavallisesti yhdestä kolmeen minuuttia, minkä jälkeen valmiste huuhdellaan vedellä.

Klassinen käyttökohde on Loefflerin seerumialustalla kasvatettu Corynebacterium diphtheriae: hoikat, usein nuijamaiset sauvat, joissa on voimakkaasti värjäytyviä metakromaattisia Babes–Ernst-jyväsiä, jotka sisältävät varastoitunutta polyfosfaattia. Kasvatusalustan ja värjäysaineen yhdistelmällä on historiallinen tausta, sillä molemmat luetaan saman bakteriologin ansioksi. Jyvästen kontrasti on yhdistelmän diagnostinen hyöty. Kurkkumätätutkimusten lisäksi väriainetta käytetään yleiseen bakteriologiseen värjäykseen viljelmistä tehdyissä sivelyvalmisteissa, Neisseria-bakteerien morfologian tarkasteluun kliinisissä sivelyvalmisteissa sekä tilanteissa, joissa Gram-värjäystä ei tarvita mutta tavallinen metyleenisinisen vesiliuos antaa liian heikon tuloksen. Värjäys on yksivärinen. Kaikki happamat rakenteet saavat jonkin sinisen sävyn. Jos menetelmä edellyttää erottelua eri väreillä, pelkkä emäs ei riitä.

Yksi käytännön varoitus: emäksiset väriliuokset heikkenevät ja saostuvat varastoinnin ja hiilidioksidin sitoutumisen myötä. Laboratoriot joko valmistavat pieniä määriä tai ostavat valmiin tuotteen ja noudattavat sen säilyvyysaikaa sen sijaan, että pitäisivät käytössä vanhaa pulloa, josta päätyy sakkaa jokaiselle objektilasille.

Polykrominen metyleenisininen: yksi nimi, useita väriaineita

Polykromisen metyleenisinisen lähtöaine on sama väriaine, mutta se hapetetaan hallitusti emäksisessä ympäristössä. Historiallisesti tätä kutsutaan kypsyttämiseksi tai polykromisoinniksi. Emäksinen vanhentaminen, kuumentaminen karbonaatin kanssa tai hapettaminen esimerkiksi dikromaatilla poistaa metyyliryhmiä dimetyyliaminosubstituenteista vaiheittain. Tuote on seos: jäljellä olevaa metyleenisinistä sekä azure B:tä (yksi metyyliryhmä poistunut), azure A:ta ja azure C:tä (pidemmälle edennyt demetylaatio), tioniinia (täysin demetyloitunut) ja metyleenivioletin ryhmään kuuluvia hapettumisen sivutuotteita. Kullakin komponentilla on oma värisävynsä ja kudosaffiniteettinsa, joten seos värjää metakromaattisesti: tumat, jyväset, musiinit ja rusto saavat kukin omat sävynsä sinisestä punaviolettiin.

Sama kemia on tunnettujen verivärjäysten taustalla. Varhaiset tutkijat havaitsivat, että emäksiseksi muutettu metyleenisininen värjäsi malarialoisten tumat violetin sävyihin, mutta heidän kypsytetyt vesiliuoksensa olivat epävakaita ja saostuivat muutamassa päivässä. Katsaus violetin verivärjäyksen keksimiseen kuvaa, miten Malachowski ja Romanowsky hyödynsivät tätä ilmiötä toisistaan riippumatta vuonna 1891, miten metanoli otettiin käyttöön väriaineen saostuman stabiloimiseksi ja sivelyvalmisteiden kiinnittämiseksi ilman kuumennusta sekä miten Giemsa myöhemmin standardoi seoksen käyttämällä mitattuja määriä azure B:tä ja eosiinia sekä glyserolia stabilointiin. Nykyaikaiset Giemsa-tyyppiset värjäysaineet polveutuvat suoraan polykromisen metyleenisinisen ja eosiinin yhdistelmästä, joka tuottaa Romanowsky-ilmiön. Eosiinin yhdistämistä ja azure B -komponenttia käsitellään tarkemmin artikkelissa Romanowsky-tyyppiset värjäykset sekä azure B:n ja eosiinin vuorovaikutus.

Koska polykrominen metyleenisininen on seos, se on luonnostaan näistä kolmesta vähiten standardoitu. Sen tarkka sävytasapaino riippuu hapetusmenetelmästä ja hapettumisen asteesta. Siksi histologisten tuotteiden toimittajat myyvät sitä erillisenä tuotteena, jonka suorituskyky testataan erikseen, eivätkä vanhentuneena Loefflerin liuoksena. Tyypillisiä käyttökohteita ovat syöttösolujen jyvästen, musiinien ja ruston metakromaattinen osoittaminen, plasmasolujen yksityiskohtien tarkastelu sekä Helicobacter pylorin osoittaminen kudosleikkeistä Goodpasture-tyyppisillä polykromisilla menetelmillä. Se on oikea valinta, kun tavoitteena on erotella rakenteita värin avulla, ja väärä valinta, kun menetelmä edellyttää selkeää, yksiväristä bakteerin ääriviivaa.

Koostumusten ja käyttötarkoitusten vertailu

Käytä taulukkoa päätöksenteon apuna. Jos näyte värjäytyy liian heikosti, muuta pH-lähtökohtaa ja valitse Loefflerin liuos. Jos kaikki värjäytyy mutta mikään ei erotu muusta, muuta väriaineen tyyppiä ja valitse polykrominen liuos. Jos Loefflerilla värjätyssä sivelyvalmisteessa jyväset näkyvät erinomaisesti mutta esihenkilö kysyy, miksi tumat ja solulima ovat saman sinisiä, vastaus on, ettei mikään emäksinen yksivärinen värjäys pysty erottelemaan niitä eri värein. Tällainen tehtävä kuuluu polykromisten värjäysten ryhmälle ja sen verivärjäysjohdannaisille.

Tavallisten sekaannusten välttäminen

Kaksi virhettä selittää suurimman osan sekaannuksista. Ensimmäinen on Loefflerin liuoksen pitäminen tavallisen metyleenisinisen vastineena, koska molemmat näyttävät pullossa sinisiltä. Niiden pH ja värjäysvoimakkuus eroavat, ja neutraalin väriaineen käyttäminen Loefflerin liuoksen sijaan poistaa juuri sen jyväskontrastin, johon menetelmä perustuu. Toinen virhe on pitää mitä tahansa vanhaa tai vahingossa vanhentunutta emäksistä sinistä liuosta polykromisena. Hallitsematon vanheneminen tuottaa koostumukseltaan ja vahvuudeltaan tuntemattoman seoksen, kun taas aidot polykromiset liuokset valmistetaan määritellyillä hapetusmenetelmillä ja verivärjäysten kehityslinjassa yhdistetään mitattuun määrään eosiinia. Historia opettaa tässä: 1890-luvun epävakaat, kypsytetyt vesiliuokset väistyivät metanolipohjaisten stabiloitujen koostumusten tieltä juuri siksi, ettei hallitsemattomia seoksia voitu valmistaa toistettavasti. Tämä kannattaa muistaa ennen diagnostisen objektilasin värjäämistä pullosta, jonka ikää ei tunneta.

Täsmälliset nimet täydentävät kokonaisuuden. Tarkista etiketistä tuotetyyppi (vesiliuos, Loefflerin liuos vai polykrominen liuos), väriainepitoisuus ja käyttötarkoitus sen sijaan, että päättelisit ne väristä. Näillä kolmella koostumuksella on yhteinen kromoforinen alkuperä. Niillä ei ole yhteistä käyttötarkoitusta.