متیلن آبی و بارتونلا: یافته‌های آزمایشگاهی و محدودیت‌های شواهد بالینی

ظرف کشت و بیمار در یک واژه، یعنی «عفونت»، مشترک‌اند، اما این واژه در آن‌ها مفهوم یکسانی ندارد. در ظرف کشت، عفونت به شمارش کلنی‌ها روی آگار محدود می‌شود. در بیمار، باکتری‌ها داخل سلول‌ها و عروق قرار دارند، داروها در خون و بافت جابه‌جا می‌شوند و دستگاه ایمنی بخشی از کار را انجام می‌دهد. اگر این دو را با هم اشتباه بگیریم، یک عدد چشمگیر آزمایشگاهی کم‌کم شبیه یک روش درمانی به نظر می‌رسد. اگر آن‌ها را جدا نگه داریم، همان عدد به چیزی تبدیل می‌شود که واقعاً هست: دلیلی برای انجام آزمایش بعدی.

هدف اصلی این مرور درباره متیلن آبی و بارتونلا، همین تفکیک است. دو مطالعه آزمایشگاهی از یک گروه پژوهشی، متیلن آبی را علیه Bartonella henselae در حالت‌های بدون رشد آزمودند. هر دو، فعالیت قوی آن را در ظروف شیشه‌ای و پلاستیکی گزارش کردند. هیچ‌کدام آن را روی انسان آزمایش نکردند.

چرا پژوهشگران فاز سکون را آزمایش می‌کنند

بیشتر آزمون‌های آنتی‌بیوتیکی از سلول‌های در حال رشد استفاده می‌کنند. این مدل، حالت دشوارتری را نادیده می‌گیرد: سلول‌هایی که تقسیم آن‌ها متوقف شده و داروهایی را تحمل می‌کنند که سلول‌های همتای در حال رشدشان را می‌کشند.

بارتونلا می‌تواند در بدن، از جمله داخل گلبول‌های قرمز و سلول‌های اندوتلیال، باقی بماند. بنابراین، این گروه پرسید کدام داروهای تأییدشده می‌توانند B. henselae را پس از ورود به فاز سکون از بین ببرند. MIC پایین علیه سلول‌های در حال رشد، توان کشتن سلول‌های فاز سکون را پیش‌بینی نمی‌کرد. ریفامپین MIC بسیار پایینی داشت، اما سلول‌های فاز سکون را به‌خوبی از بین نمی‌برد؛ در مقابل، ترکیباتی با مقادیر MIC بالاتر، آن‌ها را به‌خوبی می‌کشتند. خوانندگانی که به دنبال روشی کلی برای ارزیابی این نوع مقاله هستند، می‌توانند آن را در راهنمای خواندن پژوهش‌های متیلن آبی بیابند.

غربالگری نخست: لی و همکاران، 2019

در غربالگری فاز سکون در سال 2019 در Antibiotics از یک سویه، B. henselae JK53، استفاده شد که در محیط اشنایدر با 10 درصد سرم جنین گاوی، در دمای 37 C و با 5 درصد CO2 رشد داده شده بود. کشت‌های یک‌روزه عمدتاً شامل سلول‌های پراکنده در حال تقسیم بودند. کشت‌های پنج‌روزه، با حدود 10 به توان 8 واحد تشکیل‌دهنده کلنی بر mL، به‌عنوان کشت‌های فاز سکون در نظر گرفته شدند و تجمع‌های قابل مشاهده داشتند.

آزمون با SYBR Green I و پروپیدیوم یدید انجام شد و با مخلوط‌هایی از سلول‌های زنده و سلول‌های کشته‌شده با ایزوپروپانول کالیبره شد. از آنجا که متیلن آبی رنگ شدیدی دارد، موارد فعال ابتدا با میکروسکوپی و سپس با شمارش کلنی روی آگار خون‌دار تأیید شدند؛ شمارش کلنی، معیار نهایی سخت‌گیرانه‌تری بود.

از میان 1,581 داروی تأییدشده در غلظت 50 میکرومولار، متیلن آبی بر اساس دستگاه پلیت‌خوان 16 درصد و بر اساس میکروسکوپی 25 درصد زنده‌مانی باقی گذاشت. برای داپتومایسین این مقدار 21 درصد بود؛ برای چند آزول 22 تا 27 درصد، جنتامایسین 32 درصد، اریترومایسین 66 درصد و سیپروفلوکساسین 74 درصد. پیروینیوم پاموات در پلیت‌خوان قوی‌تر به نظر می‌رسید، اما به دلیل فلورسانس خود ترکیب، ارزیابی آن با میکروسکوپی ممکن نبود.

MIC متیلن آبی علیه B. henselae در حال رشد، 0.08 تا 0.16 میکروگرم بر mL بود. در برابر سلول‌های پنج‌روزه در فاز سکون، با غلظت 5 میکروگرم بر mL، پس از یک روز مواجهه هیچ کلنی قابل شناسایی باقی نماند؛ نتیجه‌ای هم‌سطح داپتومایسین و پیروینیوم پاموات در غلظت‌های آزمایش‌شده آن‌ها. در یک آزمون جداگانه کشتار در طول زمان، از 10 میکروگرم بر mL استفاده شد. این مقادیر، سطوح مواجهه آزمایشگاهی‌اند، نه دوز، و مقاله نیز آن‌ها را همین‌گونه بیان می‌کند. مقدار اوج پلاسمایی در انسان، نزدیک به 3.9 میکروگرم بر mL، که به آن استناد شده است، فقط برای ارائه زمینه در مقاله آمده است. مرور فارماکوکینتیک متیلن آبی توضیح می‌دهد که چرا نمی‌توان یک مقدار پلاسمایی را معادل مقدار آن در بافت دانست.

مقاله دو محدودیت را به‌صراحت بیان می‌کند. مدل زیست‌لایه‌ای وجود نداشت و ترکیب‌های متیلن آبی نیز آزمایش نشده بودند. تجمع‌های پنج‌روزه، خوشه‌هایی در کشت مایع فاز سکون بودند، نه یک آزمایش معتبر زیست‌لایه. نویسندگان خواستار پژوهش روی حیوانات، ترکیب‌های دارویی و زیست‌لایه، و نیز آزمایش در دیگر گونه‌های بارتونلا شدند.

ترکیب‌ها و سلول‌های مشتق از زیست‌لایه: ژنگ و همکاران، 2020

مطالعه پیگیری سال 2020 در BMC Microbiology همان سویه و محیط کشت را حفظ کرد، اما از کشت‌های شش‌روزه فاز سکون استفاده کرد و دو مورد را افزود که در مقاله نخست وجود نداشت: ترکیب‌های دو‌دارویی و مدل سلول‌های مشتق از زیست‌لایه.

در آزمایش داروهای منفرد با غلظت یکسان 5 میکروگرم بر mL به مدت 24 ساعت، متیلن آبی 3.2 ضربدر 10 به توان 4 واحد تشکیل‌دهنده کلنی بر mL باقی گذاشت، در حالی که این مقدار در گروه شاهد نزدیک به 2.8 ضربدر 10 به توان 10 بود. سیپروفلوکساسین، جنتامایسین و نیتروفورانتوئین در همان زمان کلنی‌های کمتری باقی گذاشتند. این نتیجه با یافته سال 2019 تفاوت دارد؛ در آن مطالعه، همان غلظت اسمی پس از یک روز هیچ کلنی قابل شناسایی باقی نگذاشت. سن کشت، تراکم و نحوه آماده‌سازی و کار با نمونه‌ها متفاوت بود؛ بنابراین، اثر کشتار از نظر جهت نتیجه تکرارپذیر بود، اما از نظر اندازه یکسان نبود. این تغییر میان اجراهای مختلف، یکی از دلایلی است که در بررسی‌های استاندارد ایمنی و تداخل‌ها، قدرت اثر آزمایشگاهی جدا از اثر بالینی در نظر گرفته می‌شود.

غربالگری ترکیب‌ها، بخشی است که بیش از همه به آن استناد می‌شود. غلظت هر جزء روی 5 میکروگرم بر mL ثابت نگه داشته شد. هم آزیترومایسین همراه با متیلن آبی و هم ریفامپین همراه با متیلن آبی، در 24 ساعت هیچ کلنی قابل شناسایی در فاز سکون باقی نگذاشتند؛ هر دو ترکیب حاوی سیپروفلوکساسین نیز همین نتیجه را داشتند. از میان 25 ترکیب دو‌دارویی آزمایش‌شده، فقط همین چهار ترکیب چنین نتیجه‌ای داشتند. هیچ تحلیل رسمی هم‌افزایی انجام نشد؛ بنابراین، اصطلاح درست «ترکیب فعال در این شرایط» است، نه «هم‌افزایی اثبات‌شده».

آزمایش زیست‌لایه، سلول‌های بازیابی‌شده از یک زیست‌لایه جوان و تخریب‌شده را بررسی کرد، نه نفوذ به یک زیست‌لایه بالغ و دست‌نخورده را. کشت‌ها پنج روز رشد داده شدند، سپس رقیق و به پلیت‌های چاهک‌دار منتقل شدند و پنج روز دیگر رشد کردند. تشکیل زیست‌لایه با رنگ‌آمیزی کریستال ویوله تأیید شد و سپس، پیش از مواجهه با دارو، زیست‌لایه با خراشیدن جدا شد. در غلظت 5 میکروگرم بر mL، متیلن آبی به‌تنهایی تا روز 6 شمار کلنی‌ها را به 2.3 ضربدر 10 به توان 2 رساند؛ یکی از بهترین نتایج میان عوامل منفرد، اما نه صفر. هر دو ترکیب حاوی متیلن آبی تا روز 6 به صفر رسیدند؛ هر دو ترکیب حاوی سیپروفلوکساسین نیز همین نتیجه را داشتند.

نویسندگان همان محدودیت‌هایی را برجسته کردند که یک خواننده دقیق نیز تشخیص می‌دهد: زیست‌لایه جوان و جداشده با خراشیدن به‌جای زیست‌لایه قدیمی و دست‌نخورده؛ یک غلظت عملی و یکسان برای همه داروها به‌جای اوج واقع‌بینانه هر دارو؛ فقط ترکیب‌های منتخب با محوریت آزیترومایسین یا ریفامپین؛ یک سویه؛ بدون حیوانات و بدون بیماران. پژوهش بعدی درباره ترکیب‌های سه‌دارویی پیشنهاد شد، اما نتیجه‌ای از آن گزارش نشد.

مقایسه طراحی مطالعات

این جدول، نکته اصلی مقاله را به‌صورت فشرده نشان می‌دهد. تمام موارد پیش از ستون آخر، مربوط به کار روی کشت هستند. هیچ‌یک از این دو مقاله داده‌ای در ستون آخر ندارند.

بارتونلا، بورلیا نیست

هر دو مقاله به Borrelia burgdorferi، اسپیروکت عامل بیماری لایم، اشاره می‌کنند؛ زیرا آزمون رنگی از پژوهش‌های پیشین همان آزمایشگاه درباره بورلیا در فاز سکون گرفته شده بود. در آن پژوهش‌ها، متیلن آبی و داپتومایسین نیز به‌عنوان ترکیبات فعال شناسایی شده بودند. این پیشینه، زمینه مفیدی فراهم می‌کند و در عین حال، منبع رایجی برای اشتباه است.

هیچ آزمایشی در این دو مقاله بارتونلا، بورلیا را هم‌زمان و در کنار بارتونلا بررسی نمی‌کند. ارگانیسم‌ها، محیط‌های کشت و غلظت‌ها متفاوت‌اند، و اثر فرضی متیلن آبی بر غشای بارتونلا نیز به‌عنوان گمانه‌ای نیازمند بررسی بیشتر مطرح شده است. نباید نتایج را از یک گونه به گونه دیگر تعمیم داد، و هیچ‌یک از این دو مقاله از ادعاهای گسترده درباره انگل‌ها پشتیبانی نمی‌کنند. به همین دلیل، مقایسه سلول‌های پایای بورلیا و بارتونلا، یافته‌های پژوهشی این دو را جدا نگه می‌دارد.

چرا نتایج کشت به پروتکل تبدیل نمی‌شوند

علاقه به جست‌وجوی پروتکل متیلن آبی برای بارتونلا قابل درک است. همین مقاله‌ها نشان می‌دهند که چرا باید این عبارت را نشانه هشدار دانست، نه فهرست خرید.

نخست، 5 میکروگرم بر mL در یک چاهک، نسخه پزشکی نیست. این مقدار هیچ اطلاعاتی درباره جذب، توزیع، اتصال به پروتئین، نفوذ داخل‌سلولی یا تحمل‌پذیری همراه ندارد. نویسندگان آن را به‌عنوان میانگینی تقریبی از اوج غلظت آنتی‌بیوتیک‌ها انتخاب کردند و گفتند پژوهش‌های آینده باید هر دارو را در غلظت واقع‌بینانه خودش بررسی کنند.

دوم، صفر بودن کلنی‌ها به معنای نبود کلنی در همان شرایط کشت روی پلیت است، نه استریل بودن بافت. سلول‌های پایا، باکتری‌های داخل‌سلولی و محدودیت‌های نمونه‌برداری، همگی خارج از محدوده پلیت آگار قرار دارند.

سوم، ترکیب‌هایی که یک چاهک را استریل می‌کنند، ممکن است در بدن شکست بخورند یا آسیب برسانند. آزیترومایسین همراه با متیلن آبی و ریفامپین همراه با متیلن آبی، ترکیب‌های آزمایشگاهی در سطوح مواجهه آزمایشگاهی هستند. بدون فارماکوکینتیک حیوانی و داده‌های کنترل‌شده انسانی، نه دوزی تعیین شده، نه مدت مصرفی و نه نسبت سود به خطر. هر کسی که گزینه‌ها را می‌سنجد، باید پیش از نتیجه‌گیری از داده‌های ظرف کشت، آن‌ها را با پزشک در میان بگذارد و بررسی کند که استفاده از متیلن آبی چه زمانی به نظارت پزشکی نیاز دارد.

نتیجه محدودی که این مقاله‌ها واقعاً از آن پشتیبانی می‌کنند، این است: متیلن آبی در شرایط برون‌تنی علیه B. henselae JK53 بدون رشد، از جمله در ترکیب‌های دو‌دارویی آزمایشگاهی، فعالیت تکرارپذیری دارد؛ قوی‌ترین نتایج مربوط به ترکیب‌ها و سلول‌های مشتق از زیست‌لایه نیز از مطالعه سال 2020 به دست آمده‌اند. هر چیز دیگری، از جمله اینکه آیا این فعالیت برای بارتونلوز انسانی اهمیت دارد یا نه، همچنان آزمایش‌نشده باقی مانده است.