آیا مصرف بیشتر اکسیژن به معنای ATP بیشتر است؟ درس‌هایی از مطالعات متیلن بلو

یک میتوکندری جداشده در محفظه‌ای حاوی سوخت، اما بدون ADP، قرار دارد. اکسیژن را به‌آرامی مصرف می‌کند. با افزودن ADP، مصرف اکسیژن چند برابر می‌شود. وقتی ADP تمام شود، مصرف اکسیژن دوباره پایین می‌آید. سوخت هیچ تغییری نکرده است؛ فقط تقاضا برای ATP تغییر کرده است.

این توالی کوتاه، تمام تمایزی را که این مقاله دربارهٔ آن است در خود دارد. مصرف اکسیژن نشان می‌دهد الکترون‌ها با چه سرعتی از زنجیرهٔ تنفسی به اکسیژن می‌رسند. تولید ATP نشان می‌دهد چه مقدار از این جریان به‌صورت انرژی قابل‌استفاده ذخیره می‌شود. این دو یک مرحلهٔ میانی مشترک دارند: شیب پروتونی در دو سوی غشای داخلی میتوکندری. هر چیزی که میزان جفت‌شدگی این شیب با سنتز ATP را تغییر دهد، می‌تواند این دو شاخص نهایی را در جهت‌های متفاوتی حرکت دهد. متیلن بلو در اینجا نمونهٔ آموزنده‌ای است، چون هر دو رفتار در آن مشاهده شده است: در برخی نمونه‌ها، مصرف اکسیژن را همراه با ATP افزایش داده و در برخی دیگر، مصرف اکسیژن را بالا برده، در حالی که ATP ثابت مانده یا کاهش یافته است.

خوانندگانی که ابتدا می‌خواهند تصویر گسترده‌تری از این انتقال مرحله‌ای داشته باشند، می‌توانند از چگونگی جابه‌جایی الکترون‌ها توسط متیلن بلو در زنجیرهٔ تنفسی شروع کنند. کسانی هم که به اصطلاحات آزمایش‌های اولیهٔ اکسیژن نیاز دارند، می‌توانند بخوانند که نخستین اندازه‌گیری‌های تنفس واقعاً چه چیزی را نشان دادند.

تنفس، ATP و شیب میان آن‌ها

الکترون‌های NADH و FADH2 از طریق کمپلکس‌های I و II وارد زنجیره می‌شوند، از کمپلکس III به سیتوکروم c می‌رسند و سپس از کمپلکس IV به اکسیژن منتقل می‌شوند. انرژی آزادشده در کمپلکس‌های I، III و IV، پروتون‌ها را از ماتریکس به فضای بین‌غشایی پمپ می‌کند. این جدایی بار و اختلاف اسیدیته، نیروی محرکهٔ پروتونی را تشکیل می‌دهد و بخش الکتریکی آن، یعنی پتانسیل غشا، معمولاً بخش غالب است.

ATP سنتاز اجازه می‌دهد پروتون‌ها به ماتریکس بازگردند و از انرژی آزادشده برای ترکیب ADP و فسفات و ساخت ATP استفاده می‌کند. بنابراین توالی چنین است:

مصرف اکسیژن، سپس پمپاژ پروتون، سپس تشکیل شیب و سپس سنتز ATP.

نکته اینجاست که پروتون‌ها می‌توانند از مسیرهای دیگری هم بازگردند. هر بازگشتی که ATP سنتاز را دور بزند، نشت پروتون است. نشت، زنجیره را وادار می‌کند همان پروتون‌ها را دوباره پمپ کند تا پتانسیل غشا ثابت بماند؛ در نتیجه، اکسیژن بیشتری مصرف می‌شود، بدون اینکه ATP بیشتری ساخته شود. نشت به‌اندازهٔ کافی شدید، به جداشدگی می‌انجامد: مصرف اکسیژن بالا می‌رود، در حالی که ATP ثابت می‌ماند یا کاهش می‌یابد و انرژی هدررفته به‌صورت گرما خارج می‌شود.

حالت 3، حالت 4 و نسبت کنترل تنفسی

اصطلاحات کلاسیک این موضوع از بررسی میتوکندری‌های جداشده آمده‌اند. حالت 3، تنفس در حضور سوبسترا و ADP است: ATP سنتاز شیب را کاهش می‌دهد، پتانسیل غشا افت می‌کند، زنجیره برای بازسازی آن سرعت می‌گیرد و مصرف اکسیژن بالاست، چون ATP ساخته می‌شود. حالت 4، تنفس پس از تمام‌شدن ADP است: ATP سنتاز بیکار می‌شود، شیب افزایش می‌یابد، پتانسیل بالای غشا در برابر پمپاژ بیشتر مقاومت می‌کند و مصرف اکسیژن تا حدی پایین می‌آید که فقط برای جبران نشت لازم است.

بنابراین نسبت کنترل تنفسی، یعنی حالت 3 تقسیم بر حالت 4، نشان می‌دهد جفت‌شدگی در نمونه تا چه اندازه برقرار است. نسبت بالا یعنی ADP کنترل قدرتمندی بر تنفس دارد. کاهش این نسبت همراه با افزایش حالت 4 یعنی نشت در حال غالب‌شدن است. نتایج متیلن بلو در ادامه را باید از این زاویه بررسی کرد.

یک الگوی ذهنی را به خاطر بسپارید: پتانسیل بالای غشا، زنجیره را کند می‌کند. کاهش این پتانسیل، آن را سرعت می‌بخشد. زنجیره به میزان دشواری پمپاژ پاسخ می‌دهد، نه مستقیماً به اینکه آیا ATP ساخته می‌شود یا نه.

وقتی شاخص‌های نهایی با هم تغییر می‌کنند

روشن‌ترین نمونهٔ جفت‌شده از بررسی میتوکندری‌های جداشدهٔ مغز خوکچهٔ هندی با کمپلکس‌های تنفسی مسدودشده به دست آمده است. در غلظت 100 nanomolar تا 1 micromolar متیلن بلو، مصرف اکسیژن در حالت استراحت، با گلوتامات به‌همراه مالات، سوکسینات یا گلیسروفسفات به‌عنوان سوخت افزایش یافت، در حالی که تنفس تحریک‌شده با ADP تغییری نکرد. در میتوکندری‌هایی که کمپلکس I یا کمپلکس III آن‌ها با مواد سمی مهار شده بود، این رنگ تولید ATP را اندکی افزایش داد، پتانسیل غشا را بازیابی کرد و جذب کلسیم را بهبود بخشید. مسیر پیشنهادی یک میان‌بر است: رنگ، الکترون‌ها را در بالادست محل انسداد دریافت می‌کند و با دورزدن کمپلکس آسیب‌دیده، آن‌ها را به سیتوکروم c می‌رساند.

نمونهٔ جفت‌شدهٔ دوم از منبعی کاملاً متفاوت برای ATP استفاده می‌کند. در میتوکندری‌های جداشدهٔ مغز با ATP سنتاز مهارشده، متیلن بلو همچنان تنفس را با تمام سوبستراهای آزمایش‌شده تحریک کرد. اما سنتز ATP فقط با آلفا کتوگلوتارات و گلوتامات افزایش یافت؛ دو سوبسترایی که سوکسینیل CoA تولید می‌کنند. با مسدودشدن ATP سنتاز توسط الیگومایسین، ATP اضافی از فسفریلاسیون در سطح سوبسترا به‌وسیلهٔ سوکسینیل CoA لیگاز در چرخهٔ اسید سیتریک حاصل شد، نه از فسفریلاسیون اکسیداتیو. این رنگ همچنین وقتی کمپلکس I و ATP سنتاز هم‌زمان مهار شده بودند، پتانسیل غشا را بازیابی کرد. در اینجا مصرف اکسیژن و ATP با هم افزایش یافتند، اما فقط زمانی که سوبسترا مسیر دوم تولید ATP را ممکن می‌کرد. با سوکسینات یا مالات، تنفس بدون تولید ATP اضافی افزایش یافت. همان رنگ، همان محفظه، سوخت متفاوت و پاسخ متفاوت.

وقتی شاخص‌های نهایی از هم جدا می‌شوند

موارد واگرایی نیز در مطالعات منتشرشده گزارش شده‌اند و به همان اندازه آموزنده‌اند. در یک مطالعهٔ میتوکندری‌های جداشدهٔ کبد موش صحرایی در سال 1997، متیلن بلو تنفس حالت 4 را در میتوکندری‌های دارای جفت‌شدگی قوی که از سوکسینات برای تنفس استفاده می‌کردند، سرعت بخشید و نسبت کنترل تنفسی را پایین آورد. این اثر از 0.5 micromolar قابل‌مشاهده بود و در 5 micromolar شدت داشت؛ غلظتی نزدیک به سطح پلاسمایی پس از یک بولوس وریدی 100 milligram. در 5 micromolar، میتوکندری‌ها متورم هم شدند، هرچند اختلال جفت‌شدگی ابتدا در غلظت‌های پایین‌تر ظاهر شده بود. این مشاهده نشان می‌دهد نشت پیش از آسیب ساختاری رخ داده، نه در نتیجهٔ آن. در میتوکندری‌های جداشده از نظر جفت‌شدگی، این رنگ تنفس را به‌شکلی اشباع‌پذیر و وابسته به غلظت تحریک کرد. مصرف اکسیژن در هر دو نوع نمونه بالا رفت، اما سنتز ATP به‌ازای اکسیژن مصرف‌شده افزایش نیافت. این نمونه‌ای کلاسیک از جداشدگی همراه با جابه‌جایی الکترون‌هاست؛ هر دو در یک مولکول.

چشمگیرترین جدایی در شبکیه دیده می‌شود. در موش‌های فاقد AIF و سلول‌های گیرندهٔ نوری تیمارشده با روتنون، متیلن بلو ضخامت شبکیه، نشانگرهای گیرنده‌های نوری و ساختار میتوکندری را حفظ کرد، نسبت NADH به NAD را کاهش داد و مسیرهای تنش، از جمله پاسخ به پروتئین‌های تاشدن‌یافته‌نشده و میتوفاژی را آرام‌تر کرد. این اتفاق بدون جبران کمبود ATP رخ داد. حفاظت بدون بازیابی انرژی یعنی اثر مشاهده‌شده از مسیر تعادل اکسایش‌کاهش و یکپارچگی میتوکندری حاصل شده بود، نه از ATP اضافی. هر کسی که بقای بافت را با بازیابی تولید انرژی برابر بداند، آن آزمایش را کاملاً اشتباه تفسیر می‌کند.

پژوهش روی میتوکندری‌های مغز، ستون هزینه‌ای نیز به همین ارزیابی اضافه می‌کند. همان غلظت‌های پایینی که وضعیت انرژی زیستی را بهبود دادند، تولید پراکسید هیدروژن را نیز در تمام شرایط آزمایش‌شده افزایش دادند و حذف آن را کند کردند. این تغییر با آزمون کالیبره‌شدهٔ Amplex اندازه‌گیری شد، نه با یک رنگ غیراختصاصی. ATP بیشتر و اکسیدان بیشتر با هم همراه بودند.

چک‌لیستی عملی برای خواندن نتایج

چهار پرسش، نتیجهٔ جفت‌شده را از نتیجهٔ جداشده متمایز می‌کنند.

نخست، واقعاً کدام شاخص نهایی اندازه‌گیری شده است؟ مصرف اکسیژن به‌تنهایی نمی‌تواند دربارهٔ ATP اطلاعات بدهد. سنتز ATP، پتانسیل غشا و نسبت کنترل تنفسی، هر کدام بخشی از اطلاعاتی را اضافه می‌کنند که الکترود اکسیژن نمی‌تواند ببیند. راهنمای خواندن ادعاهای پژوهشی دربارهٔ متیلن بلو، این دقت در انتخاب شاخص نهایی را به‌تفصیل بررسی می‌کند.

دوم، کدام سوبسترا میتوکندری‌ها را تغذیه کرده است؟ نتیجهٔ سوکسینیل CoA نشان می‌دهد انتخاب سوخت می‌تواند تعیین کند که آیا تنفس اضافی اصلاً می‌تواند به ATP اضافی تبدیل شود یا نه.

سوم، چه غلظتی استفاده شده است؟ متیلن بلو در محدودهٔ nanomolar تا غلظت‌های پایین micromolar در میتوکندری‌های مغز، بهبودهای اندکی در انرژی زیستی ایجاد کرد که با هزینهٔ افزایش اکسیدان همراه بود؛ غلظت نیم micromolar و بالاتر در میتوکندری‌های کبد، جفت‌شدگی را تضعیف کرد؛ و 5 micromolar تورم را هم به آن افزود. غلظت بخشی از سازوکار است، نه جزئیاتی حاشیه‌ای.

چهارم، نتیجه در کدام مدل به دست آمده است؟ میتوکندری‌های جداشده، مسیرهای درونی را آشکار می‌کنند، اما در سلول‌ها و بافت‌های دست‌نخورده، انتقال، احیا به شکل بی‌رنگ و مسیرهای رقیب برای دریافت الکترون‌ها نیز وارد ماجرا می‌شوند. پژوهش آزمایشگاهی دربارهٔ مقدار مادهٔ به‌کاررفته، از جمله اینکه غلظت و پروتکل چگونه اثرات متیلن بلو را شکل می‌دهند، پلی میان اعداد محفظه و هر ادعایی دربارهٔ یک فرد است.

مصرف اکسیژن، جریان الکترون را نشان می‌دهد. ATP نشان می‌دهد چه مقدار از آن جریان به‌صورت انرژی ذخیره شده است. متیلن بلو می‌تواند هر یک از این دو را تغییر دهد و آزمایش‌های بالا هر چهار حالت حاصل را نشان می‌دهند: هر دو افزایش می‌یابند؛ افزایش تنفس فقط در صورت مناسب‌بودن سوبسترا با افزایش ATP همراه می‌شود؛ تنفس بالا می‌رود، در حالی که جفت‌شدگی کاهش می‌یابد؛ و بافت حفظ می‌شود، در حالی که ATP ثابت می‌ماند. عدد روی الکترود اکسیژن، آغاز تفسیر است، نه پایان آن.