آگار EMB در برابر آگار MacConkey: انتخاب و تفسیر محیط‌های کشت

یک دانشجو همان نمونه آب را روی دو پلیت کشت خطی می‌دهد. روی یکی، کلنی‌های تیره با جلای فلزی سبز ظاهر می‌شوند. روی دیگری، کلنی‌های صورتی روشن با هاله‌ای کدر دیده می‌شوند. هر دو پلیت از همان لوله تلقیح شده‌اند، کنار هم انکوبه شده‌اند و در همان ساعت خوانده شده‌اند. دانشجو می‌پرسد کدام پلیت درست است.

هر دو پلیت درست هستند. آن‌ها به پرسش‌های متفاوتی پاسخ می‌دهند. سردرگمی زمانی ایجاد می‌شود که این دو محیط کشت به‌عنوان آزمون‌های غربالگری قابل‌جایگزینی برای باکتری‌های روده‌ای در نظر گرفته شوند. هدف مشترک آن‌ها انتخاب ارگانیسم‌های روده‌ای Gram منفی و تفکیک تخمیرکننده‌های لاکتوز از غیرتخمیرکننده‌هاست، اما این هدف را با شیمی و منطق بصری متفاوتی اجرا می‌کنند. وقتی این دو مفهوم پایه را درک کنید، انتخاب پلیت و خواندن کلنی‌ها به کاری معمول تبدیل می‌شود.

پاسخ کوتاه

آگار EMB از دو رنگ، eosin Y و methylene blue، استفاده می‌کند که هم‌زمان دو نقش دارند: رشد Gram مثبت‌ها را مهار می‌کنند و در اطراف تولیدکنندگان قوی اسید رسوب می‌کنند تا کلنی‌های تیره ایجاد شود؛ در حالت کلاسیک، Escherichia coli جلای فلزی سبز نشان می‌دهد. آگار MacConkey این وظایف را جدا می‌کند: نمک‌های صفراوی همراه با crystal violet، Gram مثبت‌ها را مهار می‌کنند، لاکتوز بستر تخمیر را فراهم می‌کند و neutral red تشکیل اسید را به‌صورت کلنی‌های صورتی یا قرمز نشان می‌دهد. اگر هدف، نمایش احتمالی و واضح E. coli باشد، EMB جایگاه مناسبی دارد. اگر هدف، تفکیک واضح صورتی در برابر بی‌رنگ میان تخمیرکننده‌ها و غیرتخمیرکننده‌های لاکتوز باشد، به‌ویژه در گردش‌کارهای مدفوع یا ادرار، MacConkey معمولاً ساده‌تر خوانده می‌شود. هیچ‌یک از این پلیت‌ها صرفاً بر اساس رنگ، یک ارگانیسم را شناسایی نمی‌کنند.

EMB: رنگ‌هایی که هم‌زمان انتخاب می‌کنند و گزارش می‌دهند

در مفهوم EMB، انتخاب و نشان‌دهی در همان مولکول‌ها ادغام شده‌اند. پروتکل آگار eosin methylene blue از ASM EMB را هم انتخابی و هم افتراقی توصیف می‌کند؛ جفت رنگ بسیاری از ارگانیسم‌های Gram مثبت را مهار می‌کند، در حالی که تخمیر لاکتوز باعث جذب و رسوب رنگ می‌شود. فرمول استاندارد Levine شامل peptone، lactose، phosphate، eosin Y، methylene blue و agar است، همان‌طور که در روش FDA BAM برای آگار Levine EMB فهرست شده است. توجه کنید که برخی فرمول‌های قدیمی‌تر EMB علاوه بر lactose حاوی sucrose نیز بودند، در حالی که Levine EMB حاوی lactose و فاقد sucrose است؛ بنابراین ثبت کنید که آزمایشگاه شما کدام فرمول را موجود دارد.

خواندن EMB یعنی رفتار رنگ‌ها را بخوانید. تخمیر شدید lactose به‌اندازه کافی اسید تولید می‌کند تا رسوب سنگین رنگ رخ دهد و در نتیجه E. coli مراکز آبی‌سیاه تیره و، در حالت کلاسیک، جلای فلزی سبز در نور بازتابی ایجاد کند. تخمیرکننده‌های ضعیف‌تر مانند Enterobacter و Klebsiella معمولاً به‌صورت کلنی‌های موکوئیدی صورتی تا بنفش و بدون آن جلا رشد می‌کنند. غیرتخمیرکننده‌هایی مانند Salmonella، Shigella و Proteus عموماً به‌صورت کلنی‌های بی‌رنگ یا نیمه‌شفاف رشد می‌کنند، زیرا افزایش ناگهانی اسیدیته لازم برای رسوب رنگ‌ها را ایجاد نمی‌کنند. Gram مثبت‌ها معمولاً مهار می‌شوند، هرچند میزان مهار نسبی است و بسته به سویه و محصول تفاوت دارد. شیمی کامل آماده‌سازی رنگ، از جمله اینکه چرا methylene blue اساساً مانند یک رنگ کاتیونی رفتار می‌کند، به بحث جداگانه‌ای درباره فرمولاسیون رنگ‌ها مربوط است و زمینه عمومی میکروسکوپی در اطلس روش‌های رنگ‌آمیزی ارائه شده است. تمرکز این مقاله بر انتخاب پلیت و خواندن آن است.

شکل بالا شماتیک است. منطق بصری مورد انتظار را نشان می‌دهد: روی EMB کلنی‌های تیره و براق، انواع موکوئیدی صورتی و انواع کم‌رنگ، در مقابل انواع صورتی و کم‌رنگ روی MacConkey. از آن برای یادگیری الگو استفاده کنید، سپس هر تفسیر را با کنترل‌های عکاسی‌شده و بروشور محصول مربوط به محیط کشت دقیق روی میز کارتان تأیید کنید.

MacConkey: وظایف جدا، قاعده بصری ساده‌تر

در مفهوم MacConkey، هر وظیفه به یک جزء جداگانه سپرده می‌شود. پروتکل آگار MacConkey از ASM همین چارچوب انتخابی و افتراقی را ارائه می‌کند و روش FDA BAM برای آگار MacConkey اجزای عملکردی را فهرست می‌کند: peptones، lactose، bile salts، salt، neutral red، crystal violet و agar. نمک‌های صفراوی همراه با crystal violet علیه Gram مثبت‌ها انتخاب ایجاد می‌کنند. Lactose بستر تخمیر را فراهم می‌کند. Neutral red به‌عنوان نشانگر pH عمل می‌کند و در محل تشکیل اسید، رنگ را به صورتی تا قرمز تغییر می‌دهد؛ گاهی در اطراف تخمیرکننده‌های قوی نیز رسوب صفرا دیده می‌شود.

قاعده خواندن عمداً ساده است: صورتی یعنی تخمیرکننده lactose، و بی‌رنگ یا کم‌رنگ یعنی غیرتخمیرکننده. E. coli به رنگ صورتی تا قرمز ظاهر می‌شود و اغلب هاله‌ای از رسوب صفرا دارد. Klebsiella و Enterobacter صورتی ظاهر می‌شوند و به‌دلیل کپسول‌هایشان اغلب موکوئیدی هستند. Salmonella، Shigella، Proteus و بسیاری دیگر از باسیل‌های Gram منفی بی‌رنگ ظاهر می‌شوند. یک مزیت جانبی در آزمایشگاه‌های آموزشی اهمیت دارد: نمک‌های صفراوی عموماً حرکت ازدحامی Proteus را کاهش می‌دهند، بنابراین دستیابی به کلنی‌های جداشده روی MacConkey نسبت به محیط‌های غیرانتخابی آسان‌تر است، هرچند این مهار مطلق نیست و در مواردی که کنترل حرکت ازدحامی اولویت دارد، گزینه‌های بدون نمک نیز وجود دارند.

دلیل مولکولی رفتار این رنگ‌ها به بار و ساختار مربوط می‌شود. Methylene blue یک رنگ کاتیونی phenothiazine است که ساختار و ویژگی‌های آن تمایلش به سطوح اسیدی باکتری‌ها را توضیح می‌دهد؛ همان تمایلی که هنگام رسوب آن در نواحی اسیدی روی EMB نیز نقش دارد.

مقایسه در یک نگاه

جدول را به‌عنوان یک روش تصمیم‌گیری بخوانید. وقتی تمرین باید طیفی از شدت تخمیر را با یک نقطه پایانی چشمگیر به دانشجویان نشان دهد، EMB این کار را انجام می‌دهد. وقتی تمرین به یک تفکیک دودویی سریع پیش از تأیید بیوشیمیایی نیاز دارد، MacConkey این کار را انجام می‌دهد.

کدام محیط کشت برای کدام نمونه

برای تمرین‌های آب با هدف شناسایی احتمالی fecal coliform یا E. coli، EMB جذاب است زیرا جلا از نظر بصری متمایز است. MacConkey نیز برای Gram منفی‌های روده‌ای مناسب است و سابقه استفاده در آزمون‌های آب دارد، اما هیچ‌یک از این پلیت‌ها جایگزین یک روش قانونی آزمون آب نیستند؛ بسته به آزمون، ممکن است محیط‌هایی مانند modified mTEC یا MI مشخص شده باشند. روشی را که آزمایشگاه شما ملزم به پیروی از آن است بررسی کنید.

برای جداسازی‌های مشابه نمونه مدفوع با هدف تفکیک تخمیرکننده‌ها از غیرتخمیرکننده‌ها، MacConkey عموماً از میان این دو کاربردی‌تر است. کار عملی روی مدفوع برای Salmonella یا Shigella معمولاً محیط‌های روده‌ای انتخابی‌تر مانند XLD یا Hektoen enteric را نیز اضافه می‌کند و تنها به MacConkey متکی نیست.

برای آموزش مشابه گردش‌کار ادرار در محیط بالینی، MacConkey را همراه با blood agar به‌کار ببرید. MacConkey تفکیک اولیه Gram منفی‌ها را فراهم می‌کند، در حالی که blood agar ارگانیسم‌هایی را بازیابی می‌کند که MacConkey مهار می‌کند. این ترکیب در توصیف‌های بالینی آماده‌سازی کشت ادرار رایج است.

برای آموزش صرفاً مفهومی، هر دو را اجرا کنید. EMB نشان می‌دهد که شدت تخمیر اهمیت دارد و یک مولکول می‌تواند دو نقش داشته باشد. MacConkey طراحی ماژولار را آموزش می‌دهد: انتخاب‌گر، بستر و گزارشگر از یکدیگر جدا هستند. دانشجویانی که E. coli شناخته‌شده، Klebsiella aerogenes شناخته‌شده و Salmonella شناخته‌شده را کنار هم روی هر دو محیط کشت خطی کشت دهند، به‌ندرت دوباره منطق این دو را با هم اشتباه می‌گیرند.

خطاهای خوانش که هر دوره تکرار می‌شوند

رایج‌ترین خطا، شناسایی صرفاً بر اساس رنگ است. صورتی روی MacConkey می‌تواند E. coli، Klebsiella، Enterobacter یا یک تخمیرکننده دیگر باشد. بی‌رنگ می‌تواند Salmonella، Shigella، Proteus، Pseudomonas یا یک غیرتخمیرکننده دیگر باشد. رنگ یک فنوتیپ غربالگری است که مسیر بررسی‌های تأییدی مانند Gram stain، oxidase، پنل‌های بیوشیمیایی یا شناسایی دستگاهی را مشخص می‌کند، نه نام گونه را.

خطای دوم، تفسیر بیش از حدِ نبود جلا است. برخی کلنی‌های واقعی E. coli، به‌ویژه کلنی‌های جداشده، روی EMB جلای فلزی اندک یا هیچ جلایی ایجاد نمی‌کنند. نبود جلا E. coli را رد نمی‌کند و وجود جلا نیز آن را اثبات نمی‌کند. جلا را یک سرنخ احتمالی در نظر بگیرید.

خطای سوم، مقایسه پلیت‌هایی با سن متفاوت است. تخمیرکننده‌های دیررس lactose ممکن است پس از انکوباسیون طولانی روی MacConkey صورتی شوند و در نتیجه مرز واضح میان تخمیرکننده و غیرتخمیرکننده را محو کنند. پلیت را در ساعت مشخص‌شده آزمایشگاه بخوانید و زمان انکوباسیون را همراه نتیجه ثبت کنید.

خطای چهارم، تفسیر رشد مخلوط به‌عنوان یک ارگانیسم است. یک کلنی صورتی در کنار یک کلنی بی‌رنگ نشان‌دهنده دو فنوتیپ است، نه یک حالت میانی. کلنی‌های کاملاً جداشده را بردارید و روی هر مورفوتیپ جداگانه کار کنید. بافت موکوئیدی نیز دام مشابهی ایجاد می‌کند: هم Klebsiella و هم Enterobacter می‌توانند موکوئیدی به نظر برسند، بنابراین کپسول به‌تنهایی هرگز نام ارگانیسم را تعیین نمی‌کند. ارگانیسمی که زمانی با نام Enterobacter aerogenes آموزش داده می‌شد، اکنون به‌عنوان Klebsiella aerogenes طبقه‌بندی می‌شود؛ همین موضوع توضیح می‌دهد چرا جدول‌های قدیمی و برچسب‌های جدید ظاهراً با هم اختلاف دارند.

کنترل‌ها و یک قاعده پایانی

در هر جلسه کنترل‌های عکاسی‌شده یا تازه اجرا کنید: E. coli برای واکنش تخمیرکننده قوی، Klebsiella aerogenes برای تخمیر موکوئیدی بدون جلای کلاسیک، یک سویه Salmonella برای واکنش غیرتخمیرکننده بی‌رنگ، و Staphylococcus aureus برای تأیید مهار Gram مثبت روی محصول دقیق شما. شماره سویه‌ها و معیارهای پذیرش را با بروشور سازنده تطبیق دهید، زیرا میزان انتخاب‌گری با مقدار صفرا، crystal violet و رنگ‌ها تغییر می‌کند.

پشت میز آزمایشگاه یک جمله را به خاطر بسپارید. EMB از رنگ‌هایی استفاده می‌کند که هم انتخاب می‌کنند و هم پیام می‌دهند؛ در نتیجه سیگنال چشمگیر E. coli را به بهای خوانشی ظریف‌تر به دست می‌آورید. MacConkey انتخاب را از گزارش‌دهی جدا می‌کند؛ در نتیجه تفکیک ساده صورتی در برابر کم‌رنگ را به بهای جزئیات کمتر درباره شدت تخمیر به دست می‌آورید. محیط کشتی را انتخاب کنید که مفهوم آن با پرسش مطابقت دارد، رنگ را با آزمون‌های مناسب تأیید کنید، و این دو پلیت دیگر رقیب یکدیگر نیستند بلکه مکمل هم می‌شوند.