Metileno urdinaren absortzio-espektroa eta absortibitate molarra: baldintzak zehazten dituen erreferentzia

Metileno urdinaren espektroak sinplea dirudi, handik ateratako zenbaki bat berrerabiltzen saiatzen zaren arte. Laborategi batek 82,000 inguruko estintzio-koefiziente molarra ematen du. Beste batek 67,000 ematen du. Hirugarren batek 100,000 baino gehiago ematen du. Hirurak izan daitezke beren neurketen deskribapen zuzenak, baina horietako bat ere ez da koloratzailearen konstante unibertsala.

Nahasmena bi kontzeptu desberdin nahastetik dator. Absorbantzia disoluzio jakin batean eta kubeta jakin batean egindako neurketa da. Absortibitate molarra, askotan epsilon gisa idatzia, disoluzio horren eredu bateko parametroa da. Metileno urdinaren asoziazio-egoera aldatzen denean, eredua aldatu egiten da, eta, beraz, parametroa ere bai. Ohitura erabilgarria da koefiziente bakoitza baldintzak zehaztuta dituen balio gisa hartzea: uhin-luzerak, disolbatzaileak, pH-ak edo tanpoiak, tenperaturak, kontzentrazio-tarteak eta bide optikoaren luzerak zenbakiarekin batera joan behar dute.

Monomeroaren banda ur-disoluzio diluituan

Ur-disoluzio diluituan, metileno urdinaren katioiaren banda nagusia 664 eta 665 nm inguruan dago; tresnen eta kalibrazio-aukeren arabera, normalean 664 eta 668 nm arteko balioak aipatzen dira. Banda hori da kuantifikaziorako aukera egokia, disoluzioa behar bezain diluitua denean koloratzailearen zatirik handiena monomero moduan egoteko.

Literaturako hiru baliok erakusten dute zergatik diren baldintzak nabarmendutako zenbakia baino garrantzitsuagoak. Ur-laginak 7 micromolar ingurutik behera eta 1 cm-ko kubetetan mantendu zituzten buztin-ikertzaileek 82,000 M-1 cm-1 inguruko epsilon balioa eman zuten 665 nm-an. Balio hori bereziki ongi dokumentatuta dago ur-lagin oso diluituen kalibrazio enpirikoaren malda gisa. Geroagoko ur deionizatuko kalibrazio primario batek, 2.34 eta 37.52 micromolar arteko kontzentrazioak eta 1 cm-ko bide optikoa erabiliz, 67,100 M-1 cm-1 inguruko balioa eman zuen 665 nm-an koloratzaile osoarentzat. Emaitza txikiago hori espero izatekoa da, ez kontraesankorra, kalibrazio-tarte horren goiko erdiak dimero kantitate nabarmena baitauka dagoeneko. Hirugarren balio bat, 73,460 M-1 cm-1 ingurukoa 664 nm-an, pH 6.86-an eta 293 K-ean egindako lan batetik dator; lan horrek behatutako espektroa monomeroaren eta dimeroaren osagaietan deskonposatu zuen, metileno urdinaren fotofisikari buruzko berrikuspen kritiko berri batean laburbiltzen den bezala. Zenbaki hori deskonboluzioz lortutako monomero-osagai bati dagokio, ez koloratzaile osoarekiko absorbantziaren malda zuzen bati.

Ondorio praktikoa: aukeratu zure laginen baldintzekin bat datorren koefizientea, edo egin zure kalibrazioa. Ez erabili 82,000 balioa 30 micromolar-eko fosfato-tanpoi batean egindako saiakuntza batean, linealtasunak bere horretan dirauela onartuta.

Uhin-luzera laburreko sorbalda nahaste bat da

Kontzentrazioa handitu ahala, 600 eta 615 nm inguruko sorbalda handitu egiten da 664 nm-ko gailurrarekiko. Egungo lanek H motako dimeroaren ekarpena 605 eta 610 nm inguruan kokatzen dute normalean. Metileno urdinaren uretako analisi espektral globalak dimeroaren maximo bat bereizten du 607 nm-an eta ordena handiagoko agregatu baten maximoa 600 nm-an, monomeroaren erresonantzia-osagaiekin batera 664 eta 650 nm-an. Testu osoa PMID 33251415 zenbakiaren sarbide irekiko erregistroan dago eskuragarri.

Sorbalda hori ez da dimero hutsaren absorbantzia gisa etiketatu behar. Monomeroaren egitura bibronikoak ere ekarpena egiten du eskualde berean; beraz, neurtutako altuera gainjartze bat da. Doikuntza global batean ikusi zen monomeroa eta dimeroa bakarrik hartzen zituen ereduak ez zuela balio 1.1 micromolar eta 3.4 millimolar arteko tarte osoan; tetrameroa gehitzeak, aldiz, doikuntzarik onena eman zuen, eta tetrameroaren seinalea 34 micromolar baino beherago ere detekta zitekeen. Doitutako osagaien intentsitateak handiak ziren: 107,800 M-1 cm-1 inguru 664 nm-an monomero-osagai nagusiarentzat, 101,400 inguru dimeroarentzat 607 nm-an, eta 138,500 inguru tetrameroarentzat 600 nm-an, tanpoirik gabeko ur deionizatuan, 0 eta 0.15 M arteko sodio kloruroarekin eta 282 eta 333 K arteko tenperaturetan. Ereduaren bidez bereizitako osagaiak dira; beraz, ez dira Beer Lambert erlazioaren malda enpirikoaren ordez erabili behar.

Dimerizazioaren indarra zuzenean kuantifikatu da. pH 6.86-an eta 293 K-ean, ikerketa batek 3,900 M-1 inguruko dimerizazio-konstantea lortu zuen. Magnitude horrek azaltzen du zergatik duen 5 micromolar-eko lan-disoluzio batek portaera ia lineala eta 50 micromolar-eko disoluzio ama batek ez. Metodoa garatzean egiaztapen erabilgarria da 610 nm inguruko absorbantziaren eta 665 nm inguruko absorbantziaren arteko erlazioa. Erlazio hori kontzentrazioarekin handitzen denean, 664 nm-ko epsilonak jada ez du espezie aldaezin bakar bat deskribatzen.

Elkarren artean bihurtzen diren bi espeziek nagusitutako kontzentrazio-tarte batean, espektroek puntu isosbestiko bera izan dezakete; ur-disoluzioen serieetan, esperimentalki, 625 nm inguruan dago. Puntu finko garbi bat bi espezie nagusi egotearekin bateragarria da. Kontzentrazioa handitu ahala puntua lekuz aldatzen edo desagertzen bada, hartu ordena handiagoko agregatuak edo oreka aldakorrak agertu diren abisu gisa, ez tresnaren akats gisa.

Disolbatzaileak, pH-ak eta tenperaturak espektroa aldatzen dute

Urak asoziazioa bultzatzen du. Dimetil sulfoxidoa gehitzeak dimerizazioa murrizten du, absortzioaren eta fluoreszentziaren maximoak uhin-luzera luzeagoetara eramaten ditu, eta fluoreszentziaren etekin kuantikoa lau aldiz inguru handitzen du, metileno urdinaren ur eta DMSO nahasteetako disolbatzaile-ikerketaren arabera, PMID 30933781 gisa indexatua. Lan horrek ur-disoluzioetako espektroak monomeroaren eta dimeroaren arteko oreka gisa aztertzen ditu, monomeroaren absorbantzia 650 eta 670 nm inguruan eta dimeroarena 580 eta 615 nm inguruan kokatuta, eta 293.15 K-ean neurtutako espektroetatik dimerizazio-konstanteak ondorioztatzen ditu.

Alkoholek bai kokapena bai itxurazko intentsitatea aldatzen dituzte, baina ez dute agregazioa ezabatzen. Metileno urdinaren disolbatzaile-ikerketa batean jasotako konparazio primario batean, 31.3 micromolar-eko kontzentrazioan eta giro-tenperaturan, uhin-luzera luzeko maximoa 665 nm-an zegoen uretan, baina 655 nm-an metanolean; disoluzio osoaren itxurazko balioak 37,100 ingurukoak ziren uretan eta 60,800 ingurukoak metanolean. Etanol absolutuan 298 K-ean egindako beste baliozkotze batek maximoa 655 nm-an eman zuen, 68,000 inguruko epsilonarekin.

Ohiko pH-aldaketek protokolo askok uste baino gutxiago aldatzen dute espektroa. Goian aipatutako berrikuspen kritikoak dio pH 2 ingurutik pH 12 ingurura maximoak 665 nm inguruan jarraitu zuela, eta intentsitate-aldaketak txikiak izan zirela pH 11ra arte. Tanpoiaren identitateak eta indar ionikoak pH nominalak bezainbeste alda ditzakete emaitzak; beraz, erregistratu benetan erabilitako tanpoia eta gatza, ez pH-metroaren irakurketa soilik. Azido sendoa edo alkali sendoa beste kasu bat da, koloratzaileak aldaketa kimikoa jasan baitezake, asoziazio itzulgarria izan beharrean. Tenperaturak eta gatzak ere oreka aldatzen dute; horregatik, 2020ko ur-ikerketak biak aldatu zituen nahita.

Zenbakiak baliozkoa izaten jarrai dezan neurtzea

Lan kuantitatiboa Beer Lambert erlazioan oinarritzen da: absorbantzia epsilonaren, kontzentrazioaren eta bide optikoaren luzeraren biderkaduraren berdina da. Horrez gain, tarte lineala zure baldintzetan benetan betetzen dela frogatu behar da.

Erabili 1 cm-ko kubeta bat micromolar mailako kontzentrazio txikiekin lan egiteko. Epsilon 82,000 ingurukoa izanik, 5 micromolar-ek 0.41 inguruko absorbantzia ematen du, eta 10 micromolar-ek 0.82 ingurukoa. Ur hutsean monomeroa neurtzeko, seguruagoa da gutxi gorabehera 5 eta 7 micromolar inguruan edo azpitik mantentzea, dozenaka micromolar-eko kontzentrazioetaraino kalibratzea baino. Disoluzio ama kontzentratuetarako, laburtu bide optikoa, 1etik oso gorako absorbantzia onartu beharrean.

Egin zuriaren neurketa matrize berdin-berdinarekin: ur-kalitate bera, kodisolbatzaile-frakzio bera, tanpoi eta gatz berak, baina koloratzaile gabe. Prestatu kalibrazio-disoluzioak matrize berean eta tenperatura berean. Garapenean, eskaneatu ikusgaiaren tarte osoa, ahal dela 550 eta 750 nm artekoa gutxi gorabehera, uhin-luzera bakar bat irakurri beharrean. Jarraitu formaren bilakaera, ez altuerarena bakarrik. Serieko diluzioek forma normalizatua aldatzen badute, sistema kimikoki kontzentrazioaren mendekoa da. Maximo egonkor bat eta 610 eta 665 nm-ko absorbantzien arteko erlazio egonkor bat tarte onargarri baten froga sendoagoak dira R karratu altu bat bakarrik baino.

Dokumentatu erreaktiboaren forma. Material komertziala metiltioninio kloruro anhidroa edo hidrato bat izan daiteke, trihidratoa esaterako; beraz, disoluzio amaren kalkuluetarako erabilitako masa molarrak bat etorri behar du botilako benetako materialarekin. Urrats horrek bakarrik azaltzen du laborategien arteko kontzentrazio molar nominalen desadostasunaren zati bat. Antzeko zorroztasuna behar da emaitzak saiakuntza kuantitatiboen kalkuluetan erabiltzen direnean, espektroak formulazioen egonkortasun-egiaztapenetarako erabiltzen direnean eta ezpurutasun-profilek purutasuna eta espezifikazioak berrikustea eskatzen dutenean.

Baldintzak zehaztuta dituen laburpena

Erabili taula hau laborategiko erregistro baten abiapuntuko txantiloi gisa, ez elkarrekin trukatzeko moduko konstanteen iturri gisa.

Metileno urdinaren absorbantziaren uhin-luzerari buruzko erantzuna, beraz, laburra da, baina oin-oharra luzea. Eman neurtu duzun gailurra, neurtu duzun disoluzioan eta neurtu duzun kontzentrazioan. Ohitura horrek eragozten du ur-disoluzio diluitu bateko 664 nm inguruko balio bat konstante unibertsal faltsu bihurtzea.