Metileno-urdina eta ATP: oxigeno gehiago erabiltzeak energia gehiago esan nahi al du?

Mitokondrio isolatu bat ganbera batean dago, erregaiarekin baina ADPrik gabe. Oxigenoa poliki kontsumitzen du. ADP gehitzean, oxigeno-kontsumoa hainbat aldiz handitzen da. ADP agortu arte itxaronez gero, oxigeno-kontsumoa berriro jaisten da. Erregaia ez da aldatu. ATP eskaria baino ez.

Sekuentzia txiki horretan dago artikulu honek jorratzen duen bereizketa osoa. Oxigeno-kontsumoak neurtzen du elektroiak arnasketa-katean zehar oxigenoraino zenbateko abiaduran igarotzen diren. ATP ekoizpenak neurtzen du fluxu horretatik zenbat atxikitzen den energia erabilgarri gisa. Biek tarteko urrats bera dute: mitokondrioaren barne-mintzean zeharreko protoi-gradientea. Gradientea ATP sintesiari zenbateraino estu akoplatuta dagoen aldatzen duen edozerk bi neurketa-emaitzak norabide desberdinetan mugiaraz ditzake. Metileno-urdina adibide argigarria da hemen, bi moduetara jokatzen ikusi baita: prestakin batzuetan oxigenoaren erabilera ATPrekin batera handitzen du, eta beste batzuetan oxigenoaren erabilera handitzen du ATP bere horretan mantentzen edo jaisten den bitartean.

Lehenik elektroi-transferentziaren ikuspegi zabalagoa nahi duten irakurleek metileno-urdinak elektroiak arnasketa-katean zehar nola garraiatzen dituen irakurriz has daitezke. Oxigenoarekin egindako lehen esperimentuen terminologia ezagutu nahi dutenek, berriz, lehen arnasketa-neurketek benetan zer erakutsi zuten irakur dezakete.

Arnasketa, ATP eta bien arteko gradientea

NADH eta FADH2 molekuletatik datozen elektroiak I eta II konplexuetan sartzen dira katean, III konplexutik igarotzen dira c zitokromoraino, eta gero IV konplexutik oxigenoraino. I, III eta IV konplexuetan askatutako energiak protoiak ponpatzen ditu matrizetik mintzen arteko espaziora. Kargaren eta azidotasunaren bereizketa hori protoi-indar eragilea da, eta haren osagai elektrikoa, mintz-potentziala, osagai nagusia izaten da normalean.

ATP sintasak protoiak matrizera itzultzen uzten ditu eta askatutako energia erabiltzen du ADP eta fosfatoa elkartuz ATP sortzeko. Beraz, katea honako hau da:

oxigeno-kontsumoa, ondoren protoien ponpaketa, ondoren gradientea, eta ondoren ATP sintesia.

Arazoa da protoiak beste bide batzuetatik ere itzul daitezkeela. ATP sintasatik igaro gabe itzultzen den edozein protoi-fluxu protoi-ihesa da. Ihesak katea protoi berak berriro ponpatzera behartzen du mintz-potentziala egonkor mantentzeko; horrek oxigeno gehiago kontsumitzen du ATP gehiago sortu gabe. Ihesa nahikoa handia bada, desakoplamendua gertatzen da: oxigenoaren erabilera handitzen da ATP bere horretan mantentzen edo jaisten den bitartean, eta alferrik galdutako energia bero gisa askatzen da.

3. egoera, 4. egoera eta arnasketa-kontrolaren erlazioa

Horri buruzko terminologia klasikoa mitokondrio isolatuetatik dator. 3. egoera substratua eta ADP daudenean gertatzen den arnasketa da: ATP sintasak gradientea murrizten du, mintz-potentziala apaltzen da, katea azkartzen da gradientea berreraikitzeko, eta oxigenoaren erabilera handia da ATP sortzen ari delako. 4. egoera ADP agortu ondorengo arnasketa da: ATP sintasa geldirik geratzen da, gradientea handitzen da, mintz-potentzial altuak ponpaketa gehiago eragozten du, eta oxigenoaren erabilera ihesa konpentsatzeko behar den mailara jaisten da.

Arnasketa-kontrolaren erlazioak, hau da, 3. egoeraren eta 4. egoeraren arteko zatidurak, prestakina zenbateraino estu akoplatuta dagoen adierazten du. Erlazio altuak esan nahi du ADPk arnasketa sendo kontrolatzen duela. Erlazioa jaisteak eta, aldi berean, 4. egoerako arnasketa handitzeak esan nahi dute ihesa nagusitzen ari dela. Ikuspegi horretatik ulertzen dira beheko metileno-urdinaren emaitzak.

Merezi du eredu mental bat gogoan izatea. Mintz-potentzial altuak katea moteltzen du. Potentziala desegiteak azkartu egiten du. Kateak ponpaketa zenbateraino zaildu den kontuan hartuta erantzuten du, ez zuzenean ATP sortzen ari den ala ez.

Neurketa-emaitzak batera aldatzen direnean

Adibide akoplatu argiena arnasketa-konplexuak blokeatuta dituzten akurien garuneko mitokondrio isolatuetatik dator. Metileno-urdinaren kontzentrazioa 100 nanomolar eta 1 micromolar artean zegoenean, atsedeneko oxigeno-kontsumoa handitu egin zen glutamatoa eta malatoa batera, sukzinatoa edo glizerofosfatoa erregai gisa erabilita; ADPk estimulatutako arnasketa, berriz, ez zen aldatu. I edo III konplexuan pozoitutako mitokondrioetan, tindagaiak ATP ekoizpena apur bat handitu zuen, mintz-potentziala berrezarri zuen eta kaltzioaren hartzea hobetu zuen. Proposatutako bidea lasterbide bat da: tindagaiak blokeoaren aurretik hartzen ditu elektroiak eta c zitokromoari ematen dizkio, kaltetutako konplexua saihestuz.

Bigarren kasu akoplatu batek erabat bestelako ATP iturri bat erabiltzen du. ATP sintasa inhibituta duten garuneko mitokondrio isolatuetan, metileno-urdinak arnasketa estimulatu zuen probatutako substratu guztiekin. Baina ATP sintesia alfa-ketoglutaratoarekin eta glutamatoarekin soilik handitu zen, sukzinil CoA sortzen duten bi substratuekin. Oligomizinak ATP sintasa blokeatzen zuenez, ATP gehigarria azido zitrikoaren zikloan sukzinil CoA ligasak egindako substratu-mailako fosforilaziotik zetorren, ez fosforilazio oxidatibotik. Tindagaiak mintz-potentziala ere berrezarri zuen I konplexua eta ATP sintasa batera inhibituta zeudenean. Hemen oxigenoaren erabilera eta ATP batera aldatu ziren, baina substratuak ATP sortzeko bigarren bidea ahalbidetzen zuenean soilik. Sukzinatoarekin edo malatoarekin, arnasketa handitu zen ATP gehigarririk gabe. Tindagai bera, ganbera bera, erregai desberdina, erantzun desberdina.

Neurketa-emaitzak bereizten direnean

Bereizketa-kasuak ere argitaratuta daude, eta besteak bezain argigarriak dira. 1997ko arratoien gibeleko mitokondrio isolatuei buruzko ikerketa batean, metileno-urdinak 4. egoerako arnasketa azkartu zuen sukzinatoa erabiliz arnasten zuten eta estu akoplatuta zeuden mitokondrioetan; horren ondorioz, arnasketa-kontrolaren erlazioa jaitsi egin zen. Eragina 0.5 micromolar-eko kontzentraziotik aurrera ikus zitekeen, eta handia zen 5 micromolar-eko kontzentrazioan; kontzentrazio hori 100 milligram-eko zain barneko bolo baten ondorengo plasma-mailen antzekoa da. 5 micromolar-eko kontzentrazioan mitokondrioak puztu ere egin ziren, nahiz eta akoplamenduaren akatsa lehenago agertu, kontzentrazio txikiagoetan. Horrek iradokitzen du ihesa egitura-kaltearen aurretik gertatu zela, ez kaltearen ondorioz. Mitokondrio desakoplatuetan, tindagaiak arnasketa estimulatu zuen modu saturagarrian eta kontzentrazioaren arabera. Oxigenoaren erabilera handitu zen bi prestakinetan. Kontsumitutako oxigeno bakoitzeko ATP sintesia, ordea, ez. Molekula berean gertatzen diren desakoplamenduaren eta elektroi-garraioaren adibide klasikoa da hori.

Bereizketa deigarriena erretinan ikusten da. AIF gabezia duten saguetan eta rotenonaz tratatutako zelula fotohartzaileetan, metileno-urdinak erretinaren lodiera, fotohartzaileen markatzaileak eta mitokondrioen egitura mantendu zituen, NADH eta NAD arteko erlazioa jaitsi zuen eta estres-bideak apaldu zituen, besteak beste tolestu gabeko proteinen erantzuna eta mitofagia. Hori guztia ATP gabezia zuzendu gabe egin zuen. Energia berrezarri gabe babesteak esan nahi du onura redox-orekaren eta mitokondrioen osotasunaren bidez gertatu zela, ez ATP gehigarriaren bidez. Ehunaren biziraupena energia-ekoizpena berrezartzearekin parekatzen duen edonork erabat gaizki interpretatuko luke esperimentu hori.

Garuneko mitokondrioen ikerketak kostuen zutabe bat gehitzen dio balantze berari. Bioenergetika hobetu zuten kontzentrazio baxu berek hidrogeno peroxidoaren sorrera ere handitu zuten probatutako baldintza guztietan, eta haren ezabaketa moteldu zuten. Hori Amplex saiakuntza kalibratu batekin neurtu zen, ez tindagai ez-espezifiko batekin. ATP gehiago eta oxidatzaile gehiago batera etorri ziren.

Irakurtzeko egiaztapen-zerrenda praktikoa

Lau galderak bereizten dituzte emaitza akoplatuak eta desakoplatuak.

Lehenik, zer neurtu zen benetan. Oxigeno-kontsumoak bakarrik ezin du ATPari buruzko informaziorik eman. ATP sintesiak, mintz-potentzialak eta arnasketa-kontrolaren erlazioak oxigeno-elektrodoak ikusi ezin duen informazio-zati bana gehitzen dute. Metileno-urdinari buruzko ikerketa-baieztapenak irakurtzeko gidak zehatz azaltzen du neurketa-emaitzak zorrotz bereizteko modu hori.

Bigarrenik, zer substratuk elikatu zituen mitokondrioak. Sukzinil CoAren emaitzak erakusten du erregaiaren hautaketak erabaki dezakeela arnasketa gehigarria ATP gehigarri bihur daitekeen ala ez.

Hirugarrenik, zer kontzentrazio erabili zen. Garuneko mitokondrioetan, metileno-urdinak nanomolar mailatik micromolar maila baxurainoko kontzentrazioetan hobekuntza bioenergetiko apalak eman zituen, oxidatzaileen kostuarekin; gibeleko mitokondrioetan, micromolar erditik gora akoplamendua ahuldu zen; 5 micromolar-eko kontzentrazioan puztea ere agertu zen. Kontzentrazioa mekanismoaren parte da, ez testuinguruko xehetasun hutsa.

Laugarrenik, zer eredutan lortu zen emaitza. Mitokondrio isolatuek barne-konexioak agerian uzten dituzte, baina zelula eta ehun osoetan garraioa, forma koloregabera erreduzitzea eta elektroiak hartzeko lehian dauden beste hartzaile batzuk ere sartzen dira jokoan. Laborategiko dosifikazio-lanak, kontzentrazioak eta protokoloak metileno-urdinaren eraginak nola moldatzen dituzten barne, ganberako zenbakien eta pertsona bati buruzko edozein baieztapenen arteko zubia dira.

Oxigeno-kontsumoak elektroi-fluxua adierazten du. ATPk fluxu horretatik zenbat atxiki den adierazten du. Metileno-urdinak bietako edozein alda dezake, eta goiko esperimentuek horren ondoriozko lau konbinazioak erakusten dituzte: biak handitzen dira; arnasketa handitzen da substratuak ahalbidetzen duen tokietan soilik; arnasketa handitzen da akoplamendua jaisten den bitartean; eta ehuna mantentzen da ATP bere horretan geratzen den bitartean. Oxigeno-elektrodoaren zenbakia interpretazioaren hasiera da, ez amaiera.