Paul Ehrlich ja metüleensinine: katsed värvainetega

Paul Ehrlichi panus meditsiini ei olnud ravim. See oli arutluskäik selle kohta, kuidas ravimile läheneda.

aastal esitas ta doktoritöö, mille avaosa kandis pealkirja „Värvimise keemiline käsitlus“. Selle põhiväide oli, et koelõigu ja kangatüki värvimine järgivad sama loogikat. Mõlemal juhul kinnitub värv värvaine ja materjali vahelise keemilise afiinsuse tõttu, mitte seepärast, et kude oleks imav, rasvane või pigmendi kinnipüüdmiseks sobiva kujuga. Ehrlich oli üles kasvanud, jälgides oma nõbu, patoloog Karl Weigertit, värvitud koelõike valmistamas. Tema tähelepanu köitis aga mitte pilt, vaid asjaolu, et värvaine valis, kuhu minna.

See väide kõlab tagasihoidlikult. Seda see ei ole. Kui värvaine seondub koega keemilistel põhjustel, siis annab värvumismuster teavet selle koe keemiliste omaduste kohta. Värvitud preparaat lakkab olemast illustratsioon ja muutub mõõtmistulemuseks.

Ta arendas seda mõtet kohe edasi. 1880. aastal ühendas ta metüleensinise happelise fuksiiniga ning nimetas segu neutraalseks värvaineks, neutralen Farbkörper. See eristas eri tüüpi valgevereliblesid viisil, mida tollal kasutatud üksikvärvained ei võimaldanud. Kaks aastat hiljem tutvustas ta metüülvioletil põhinevat meetodit tuberkuloosibatsillide värvimiseks ning Koch võttis selle oma töös kasutusele.

Teooria, mis andis neile võtetele hiljem ühise aluse, on omaette teema ning selle ajastus kipub käsitlustes hägustuma. Ehrlichi külgahelateooria — mõte, et aine toimib rakule, kuna need kaks on keemiliselt sobivad — pärineb 1890. aastatest, mitte värvainekatsete ajast. Varasem töö andis selle eelduseks olnud veendumuse: selektiivsus on keemiline ning seetõttu saab seda sihipäraselt otsida, mitte üksnes juhuslikult avastada.

Katse, mis muutis värvaine kaardiks

aastal avaldas Ehrlich monograafia organismi hapnikuvajadusest, mille alapealkiri nimetas seda värvianalüütiliseks uurimuseks. Meetod seisnes värvainete süstimises, mille värvus sõltub oksüdatsiooniastmest, ning seejärel võrdlemises, kuidas eri elundid neid redutseerisid või muutumatuna säilitasid. Värvainet kasutati mõõtevahendina, nagu kasutatakse termomeetrit: see andis teavet koesiseste tingimuste kohta, mida ei saanud vahetult uurida. Ehrlichi enda sõnul oli eesmärk määrata kindlate värvainete abil elusate elundite redutseerimisvõime.

Metüleensinise tulemus ilmus 1886. aastal artiklis värvaine reaktsioonist elusa närvikoega, mis oli eelmisel detsembril arstide seltsis ette kantud. Metüleensinine viidi eluslooma vereringesse, seejärel eemaldati õhukesed koelõigud ja jäeti õhu kätte, et kogunenud värvitu värvaine oksüdeeruks tagasi siniseks ning näitaks, kuhu see oli kogunenud. Närvirakud ja närvikiud värvusid ning tegid seda piisavalt selektiivselt, et tehnikast sai närvikoe nähtavaks tegemise standardmeetod. Ühend ei olnud enam pelgalt värvaine, mida kanti laborilaual surnud koelõigule. Sellest oli saanud marker, mis jaotus elusorganismis ning mille jaotumist sai jälgida.

Mõlema katse aluseks olev omadus väärib selget sõnastamist, sest kõik muu selles loos sõltub sellest. Metüleensinise muutused on pöörduvad. Selle redutseeritud vorm, leukometüleensinine, on värvitu ning hapnikuga kokku puutudes muutub see tagasi siniseks katiooniks. Värvaine glükoosilahus on suletud purgis värvitu; purgi avamisel muutub see siniseks. Ehrlich olevat seda otseselt näidanud, töödeldes värvitud koelõike nii raudkloriidi kui ka õhuga ning jälgides värvuse taastumist. Värvaine, mille värvus muutub koos ümbritseva keskkonna redoksseisundiga, on selle keskkonna uurimisvahend.

Seega ilmnesid kõrvuti kaks omadust. Värvaine suutis eristada üht kude teisest. Ja värvaine värvust sai oksüdatsiooniastme muutmisega sisse ja välja lülitada.

Tagantjärele vaadates on teine omadus keemiaravi algus. Kui ühend seondub üht tüüpi koega, aga mitte teisega, siis võib sama ühend jõuda üht tüüpi organismi, aga mitte teise. Ehrlich sõnastas järelduse otse: kui haigustekitajat saab selektiivselt värvida, võib värvumine osutada just sellele haigustekitajale avalduvale kahjulikule toimele. Värvaine võiks seega olla kasutatav ravimina, mille sihtmärk on sissetungija, mitte patsient.

Esimene katse patsiendil ei puudutanud malaariat. 1890. aastal teatas Ehrlich koos psühhiaater Arthur Leppmanniga, et metüleensinine leevendas lihaste, liigeste ja kõõluste neuralgiliste ning reumaatiliste seisunditega seotud valu. Kaks meest arutasid, kas ravim võiks toimida psüühikahäirete korral, ning otsustasid seda mitte proovida. Genovast pärit Itaalia arst Pietro Bodoni tegi seda siiski. Tema 1899. aasta artikli pealkiri käsitleb rahustavat toimet psühhoosi eri vormide korral: ta kirjeldas neljateistkümne erutunud patsiendi rahunemist ning märkis, et teised Genova arstid kasutasid värvainet juba samal eesmärgil. Rahustav toime ei ole toime haigusele ning see eristus kerkib selles ajaloos korduvalt esile.

Malaariauuring tehti 1891. aastal koos patoloog Paul Guttmanniga Berliini Moabiti haiglas. Metüleensinist anti kahele patsiendile ning aruanne ilmus Berliner klinische Wochenschrifti 1891. aasta 28. septembri numbris. Esimesel juhul võttis patsient 29. juuni õhtul korraga 0.5 g värvainet; oodatud haigushoog ei kujunenud täielikult välja ning ainus hiljem registreeritud kaebus oli kerge stranguuria koos sinise uriiniga. Palavikuhood kadusid esimestel päevadel ning parasiidid olid verest kadunud hiljemalt kaheksandaks päevaks. Autorite endi kokkuvõte oli, et nende ootused olid täielikult täitunud. Kaks kontrollrühmata haigusjuhtu ei ole tõestus. Põhjalikum käsitlus metüleensinisest ja malaariast, sealhulgas tänapäevastest uuringutest, kuulub eraldi lehele. Siin on huvipakkuv küsimus kitsam: kui suur osa Ehrlichi arutluskäigust pidas vastu kokkupuutele parasiidiga.

Kus arutluskäik pidas vastu ja kus mitte

Mehhanismist ei jäänud kuigi palju alles, vähemalt mitte Ehrlichi pakutud kujul. Korrapärane seletus, mille järgi lame tritsükliline katioon libiseb parasiidi DNA aluspaaride vahele, ei pea Plasmodium’i puhul paika. Nakatunud punaverelible redutseerib metüleensinise nii kergesti, et see ei jõuagi parasiidini tasapinnalise katioonina. Akridiinvärvainete puhul sobiv interkalatsiooniselgitus sellele värvainele ei sobi.

Tõendid toetavad vähem korrastatud pilti. Metüleensinine pärsib parasiidi glutatioonreduktaasi kontsentratsioonidel, mida on võimalik patsiendi organismis saavutada. See takistab heemi muundumist hemosoiiniks — inertseks pigmendiks, mida parasiit moodustab, et vältida mürgistumist enda seeditud hemoglobiini tõttu — ligikaudu sama tõhusalt kui klorokviin ja märksa tõhusamalt kui kiniin. Selle redokstsükkel tekitab ka reaktiivseid hapnikuühendeid rakus, mis neid juba niigi toodab. Milline neist on tegelik toimemehhanism või kas kõik annavad oma panuse, ei ole endiselt selge.

On veel üks asjaolu, mis peaks mõjutama seda, kuidas selle ühendi kohta esitatud ajaloolisi väiteid lugeda. Tollane kaubanduslik metüleensinine ei olnud üksainus aine. Proovid sisaldasid Azure B-d, ühe metüülrühma võrra demetüülitud analoogi, ning vanemates lahustes kogunes seda rohkem. Azure B on teistsuguste sihtmärkidega metakromaatiline värvaine: see värvib kaheahelalise DNA tumesiniseks ja RNA roheliseks. Kahe eri sihtkohta liikuva värvaine segu, mille koostise proportsioone keegi ei registreerinud, ei võimalda üheselt öelda, mida selles sisalduv metüleensinine tegi.

Värvaine ise ei tõrjunud kiniini kunagi välja. Meetodil läks paremini. Ehrlichi õpilane Wilhelm Roehl, kes töötas värvaine- ja ravimikontsernis IG Farben, jätkas värvaine derivaatide arendamist troopikahaiguste ravimiteks ning andis puuduva töövahendi: linnumalaariaga nakatatud kanaarilinnu, mida kasutati rutiinselt kandidaatühendite sõelumiseks. Seejärel muutis Werner Schulemann külgahelat ning saadud fenotiasiiniumsool ravis katseliselt tekitatud nakkuse. Patsiente värvis see endiselt siniseks.

Püsivaks tulemuseks ei osutunud ei värvaine ega tsüklisüsteem, vaid külgahel. Dialküülaminoalküülaminorühma lisamine muutis molekuli käitumist ning see fragment säilis kõigis hilisemates ümberkujundustes. Kui säilitada see rühm ja asendada fenotiasiiniumitsükkel akridiiniga, on tulemuseks kinakriin. Kui asemele panna kinoliin, on tulemuseks klorokviin. Pamakviin, primakviin ja amodiakviin, mis kõik kuuluvad endiselt malaariavastaste ravimite hulka, sisaldavad sama rühma. Ühend, mis ravimina ei õnnestunud, andis osa, mis osutus edukaks.

Seos antipsühhootikumidega kulgeb tsükli, mitte ravimi kaudu. Metüleensinise struktuuri väljaselgitamine viis Heinrich August Bernthseni 1883. aastal fenotiasiini põhituumani. Just selle eri viisil asendatud põhistruktuuriga töötasid Rhône-Poulenci keemikud 1940. aastatel antihistamiinikume otsides. Üks neist ühenditest sünteesiti 1950. aasta lõpu paiku ning seda katsetas kirurg Henri Laborit, kes märkas, et see muutis patsiendid rahulikuks ja ükskõikseks. Selle esimene avaldatud psühhiaatriline kasutus, maaniaga patsiendil, pärineb 1952. aasta jaanuarist. Esimene antipsühhootikum ei ole niivõrd Ehrlichi malaariaravimi järeltulija kui selle värvaine kauge sugulane, millest ta alustas.

Kolm mõtteviisi, mida sellest loost tasub kaasa võtta

„Esimene meditsiinis kasutatud sünteetiline ravim“ kirjeldab kategooriat ning vajalikud täpsustused on ulatuslikumad, kui see väljend mõista annab. Väljend on kinnistunud; Schirmeri ja kolleegide sageli tsiteeritud ülevaade ajakirjas Neurobiology of Aging nimetab metüleensinist kõige esimeseks täielikult sünteetiliseks ravimiks, mida meditsiinis kasutati. Kloraalhüdraat võeti sünteetilise rahustina kasutusele 1869. aastal, rohkem kui kakskümmend aastat varem. Osa vastusest annab 1891. aasta artikkel ise, sest selle autorid nimetavad sünteetilisi palavikualandajaid, mis olid malaaria vastu juba ebaõnnestunud, nende hulgas kinoliini, antipüriini ja antifebriini. Ehrlichi enda arseeniühendil põhinev süüfiliseravim tuli veelgi hiljem. Väite kaitstav versioon puudutab pigem meetodit kui esmasust: metüleensinine kuulub varaseimate sünteetiliste ühendite hulka, mis valiti konkreetse organismi vastu toimima selektiivsuse keemilise teooria alusel.
Selektiivne jaotumine ei tähenda selektiivset kasu. Ehrlichi 1886. aasta tulemus näitas, et värvaine liigub närvikoesse. Kuhu ühend liigub ja mida see kohale jõudes teeb, on kaks eri mõõtmist ning esimest on märksa lihtsam teha. Sellesse lõhesse on sellest ajast peale jäänud enamik väiteid metüleensinise ja aju kohta.
Puhtus kuulub tõendite, mitte turunduse juurde. Ajalooline andmestik on mitmetähenduslik just sel põhjusel. Väikesed struktuurierinevused muudavad seda, kuhu ühend liigub. Seetõttu peab analüüsisertifikaat olema seotud konkreetse partiiga, mitte esitatud lihtsalt kinnitusena, et toodet on testitud. Müüja, kes väidab vastavust farmakopöa monograafiale, kuid testib ainult raskmetalle, väidab rohkem, kui aruanne tõendab. Blupreme hangib metüleensinist ravimitootjalt ning kontrollib kõiki monograafias sätestatud näitajaid: identsust, puhtust, orgaanilisi lisandeid, lahustijääke, elementlisandeid, kuumutusjääki, mikrobioloogilisi piirväärtusi ja bakteriaalseid endotoksiine. Aruanne avaldatakse toote juures ning USP kvaliteediklassi metüleensinise leht selgitab neid piirväärtusi ja seda, miks tuleks esimesena vaadata Azure B tulemust.

Allikate kronoloogia

Aeg	Mida tehti	Kus see on kirjas
1878	Doktoritöö väidab, et kudede ja tekstiilide värvimine järgivad sama keemilise afiinsuse loogikat	Ehrlich, doktoritöö, Leipzig, 1878; selle esimese osa pealkiri on „Värvimise keemiline käsitlus“
1880	Metüleensinine koos happelise fuksiiniga, „neutraalne värvaine“, eristab valgevereliblede tüüpe	Krafts, Hempelmann ja Skórska-Stania, Parasitol Res 111:1-6, 2012
1882	Berliini arstide seltsile tutvustatakse metüülvioletil põhinevat meetodit tuberkuloosibatsillide värvimiseks ning see avaldatakse järgmisel aastal	Ehrlich, Berliner klinische Wochenschrift 20:13, 1883
1885	Värvianalüütiline monograafia kasutab redoksvärvaineid elundite redutseerimisvõime võrdlemiseks	Ehrlich, Das Sauerstoff-Bedürfniss des Organismus, Berliin, 1885
1886	Elusloomale süstitud metüleensinine märgistab selektiivselt närvikude	Ehrlich, „Metüleensinise reaktsioonist elusa närvikoega“, Deutsche Medizinische Wochenschrift 12(4):49-52, 1886
1888	Metüleensinine koos eosiiniga värvib vereäietes malaariaparasiidi	Chęciński, Centralblatt für Bakteriologie und Parasitenkunde 3(15):457-460, 1888
1890	Teatatakse, et metüleensinine leevendab neuralgilist ja reumaatilist valu	Ehrlich ja Leppmann, Deutsche Medizinische Wochenschrift 16(23):493-494, 1890
1891	Berliini Moabiti haiglas antakse metüleensinist kahele malaariaga patsiendile	Guttmann ja Ehrlich, „Metüleensinise toimest malaaria korral“, Berliner klinische Wochenschrift 28(39):953-956
1897	Külgahelateooria esitatakse väljakujunenud kujul difteeriaseerumit käsitlevas artiklis	Ehrlich, Klinisches Jahrbuch 6:299-326, 1897
1899	Teatatakse metüleensinise rahustavast toimest psühhoosi eri vormide korral	Bodoni, Clinica Medica Italiana 24:217-222, 1899
1926	Nakatatud kanaarilinnust saab rutiinne mudel malaariavastaste ühendite sõelumiseks	Roehl, Deutsche Medizinische Wochenschrift 52, 1926
1932	Külgahela asendamine ravib katseliselt tekitatud nakkuse	Schulemann, Proc R Soc Med 25:897-905, 1932
1934	Akridiinitsükkel asendatakse kinoliiniga, mille tulemusel saadakse klorokviin	Krafts ja kolleegid, 2012, tuginedes Bayeri arhiivimaterjalidele
1950	Rhône-Poulencis sünteesitakse asendatud fenotiasiin, mis saab hiljem nimeks kloorpromasiin; avaldatakse 1952	Charpentier ja kolleegid, Comptes rendus de l'Académie des Sciences 235:59-60, 1952
1952	Kloorpromasiini esimene avaldatud psühhiaatriline kasutus	Delay, Deniker ja Harl, Annales médico-psychologiques 110:112-117, 1952

Verstapostide kronoloogia, sealhulgas Ehrlichile eelnenud värvainekeemia ning tema ajale järgnenud kvaliteediklassid ja spetsifikatsioonid, on eraldi esitatud metüleensinise ajaloos. Ühendi enda olemust käsitleb leht mis on metüleensinine.

Selle käsitluse aluseks olevad illustratsioonid, mis on taasavaldatud Kraftsi, Hempelmannni ja Skórska-Stania 2012. aasta ülevaates, ei ole võrdväärsed ning üks näide näitab, miks. 1891. aasta lehekülg on katse esmane dokument; selle kõrval olev 1910. aasta portree annab ajalise pidepunkti mainele ja ei millelegi muule. Andersagi 1934. aasta märkmiku leheküljed on kinoliiniga asendamise otsene jälg, keemiku enda käega kirja pandud.

Ehrlichi värvainekatsete aus kokkuvõte on see, et ta tabas selektiivsust ja sihtmärki, kuid eksis mehhanismis. Metüleensinine tõepoolest koguneb närvikoesse ja tõepoolest kahjustab malaariaparasiiti. Teine ei toimu esimese tõttu ning keemiline põhjendus, mille ta mõlemale pakkus, oli vale. See, mida ta vaieldamatult näitas, osutus õigest mehhanismist püsivamaks: ühendit saab sihipäraselt valida, mitte lihtsalt leida, ning valida tõendite alusel, mis on kogutud enne, kui keegi seda patsiendile annab.