Miks metüleensinise neeldumine muutub koos kontsentratsiooniga

Võtke üks pudel metüleensinise põhilahust ja valage sellest kaks klaasitäit. Täitke esimene põhilahusega ja teine kümnekordse lahjendusega. Teine klaas on ootuspäraselt kahvatum. Lähemalt vaadates on aga veel midagi muutunud. Värvitoon on nihkunud. Üks lahus on pigem selge taevasinine, teine violetse varjundiga sinine. Lahjendamine ei vähendanud üksnes intensiivsust. See muutis seda, milline keemiline vorm neelab kõige rohkem valgust.

Selle nihke taga olev põhimõte on lihtne. Lahustunud metüleensinine ei esine ainult ühe keemilise vormina. Üksik värvainekatioon ehk monomeer võib teise katiooniga tasapindu pidi kohakuti asetuda ja moodustada dimeeri ning dimeeridest võivad tekkida suuremad agregaadid. Igal vormil on oma neeldumisspekter. Spektrofotomeetri näit on selles küvetis ja neis tingimustes esineva segu neeldumise summa. Segu koostise muutudes muutub ka spekter, isegi kui värvaine üldsisaldus väheneb täpselt lahjendussuhte järgi.

Monomeer ja dimeer neelavad erinevalt

Kujutlege monomeeri lameda kaardina, mille positiivne laeng on jaotunud üle selle tsüklilise struktuuri. Kaks sellist kaarti võivad asetuda tasapindu pidi vastamisi. Positiivsed laengud tõukuvad, kuid lamedad aromaatsed pinnad tõmbuvad virnastumisvastastikmõjude tõttu ning ümbritsev vesi ja vastasioonid varjestavad tõukumist. Tulemuseks on seotud paar ühiste elektronolekutega. Selle lubatud üleminekud on suurema energiaga kui monomeeri üleminek, mistõttu dimeeri neeldumisriba paikneb lühemal lainepikkusel kui monomeeri oma. Suuremad agregaadid annavad täiendava panuse veelgi sinisema spektriosa suunas õlana.

Väga väikese kontsentratsiooni korral puhtas vees domineerivad monomeerid ja pika lainepikkuse neeldumisriba. Üldkontsentratsiooni suurenedes kasvab paaridena esineva vormi osakaal ning lühema lainepikkuse neeldumisriba tugevneb esimese suhtes. Kahe riba suhe näitab seega segu koostist, mitte otseselt üldkontsentratsiooni. Ühel lainepikkusel tehtud mõõtmine ei võimalda neid kaht eristada ilma eelduseta selle kohta, milline vorm lahuses esineb.

Seetõttu tuleb võrdlusspektreid alati käsitleda koos mõõtmistingimustega. Metüleensinise spektraalne võrdlusmaterjal esitab tabelina neeldumisribade asukohad koos lahusti, soolatausta, pH, temperatuuri ja kontsentratsioonivahemikuga, mille korral need saadi. Kui esitada tipu asukoht ilma nende tingimusteta, pole arv piisavalt määratletud. Kaks laborit võivad sama värvaine erinevate spektrite kohta mõlemad õiged olla, sest nad mõõtsid erineva koostisega segusid.

Mis nihutab tasakaalu

Kontsentratsioon on peamine mõjutegur. Dimeeri tekkimiseks peavad kohtuma kaks monomeeri, mistõttu selle osakaal kasvab värvaine üldkontsentratsioonist kiiremini kui lineaarselt. Toatemperatuuri lähedal jäävad vesilahuste avaldatud dimeriseerumiskonstandid suurusjärku tuhanded pöördmolaarsed ühikud, mistõttu dimeeri osakaal kasvab mikromolaarses vahemikus järsult. Laias, mikromolaarsest millimolaarse värvainekontsentratsioonini ulatuvas vahemikus tehtud üldine sobitus näitas tetrameeri nullist erinevat panust juba alla 34 mikromolaarse kontsentratsiooni. See hoiatab, et kümnete mikromolaaride juures ei tasu usaldada rangelt kahel keemilisel vormil põhinevat sobitust. Täpsed osakaalud sõltuvad keskkonnast, mistõttu see artikkel kirjeldab muutuste suundi, mitte ei anna universaalset teisendustabelit.

Sool on teine mõjutegur. Lahustunud ioonid varjestavad kahe katiooni vahelist tõukumist, mistõttu lisatud naatriumkloriid ja sarnased elektrolüüdid nihutavad segu sama värvainekontsentratsiooni juures dimeeride ja agregaatide poole. See mõju ilmneb metüleensinise agregeerumise uuringutes soolalahustes ja vesikeskkondades, kus mõõdeti värvainet kontsentratsioonivahemikus ligikaudu 1 mikromolaarsest kuni 3.4 millimolaarseni ning naatriumkloriidi vahemikus 0 kuni 0.15 molaarset. Selles sobituses ulatus tetrameeri osakaal suure värvaine- ja soolakontsentratsiooni korral ligikaudu 0.93-ni. Vees ja füsioloogilises soolalahuses mõõdetud spektrid ei ole seega omavahel asendatavad võrdlusalused.

Temperatuur mõjub vastassuunas. Virnastumine vabastab seotud vett ning soojusliikumine toimib sellele vastu. Seetõttu laguneb lahuse soojendamisel tavaliselt osa dimeere tagasi monomeerideks, jahutamine aga soodustab assotsiatsiooni. Sobitatud dissotsiatsioonientalpia on negatiivne, ligikaudu miinus 30 kilodžauli mooli kohta vahemikus 282 kuni 333 kelvinit, mis kinnitab eksotermilist assotsiatsiooni. Kohe pärast külmkapist võtmist mõõdetud külm proov võib paista rohkem agregeerunud kui sama proov pärast toatemperatuuriga tasakaalustumist.

Lahusti määrab lähteseisundi. Vesi soodustab oma tugeva hüdrofoobse efekti tõttu lamedate värvainekatioonide virnastumist. Alkoholid, näiteks etanool ja metanool, solvateerivad tsükleid paremini ning lõhuvad agregaate. Seetõttu paistab sama kontsentratsiooniga värvaine etanoolis rohkem monomeersena kui vees. Aprootilised kaaslahustid toimivad samamoodi: vee ja DMSO segudes temperatuuril 293 kelvinit pärssis lisatud DMSO dimeriseerumist, mis osutab vee struktuurile kui virnastumise soodustajale. Pindaktiivsete ainete puhul tuleb arvestada mõlema võimaliku mõjusuunaga. Üle kriitilise mitsellikontsentratsiooni võivad mitsellid monomeere ükshaaval solubiliseerida ja taastada monomeerile iseloomuliku spektri. Sellest piirist allpool võib vastaslaenguga pindaktiivne aine hoopis virnastumist soodustada: 100 mikromolaarse värvainekontsentratsiooni juures saavutas SDS-i põhjustatud polümeriseerumine maksimumi ligikaudu 4 millimolaarse SDS-i korral, umbes poolel mitsellide tekke piirist, enne ümberjaotumist suurema pindaktiivse aine sisalduse juures. Värvaine ja lahusti ning organiseeritud keskkondade mõju metüleensinise spektritele käsitlev töö näitab, kui tugevalt määrab vaadeldavaid neeldumisribasid vahetu molekulaarne ümbrus, mitte ainult üldkontsentratsioon.

pH on oluline peamiselt äärmuslikes tingimustes. Enamikus laboritöödes kasutatavas neutraalse pH lähedases vahemikus püsib metüleensinine oma tuttavas katioonses sinises vormis ning spektraalseid muutusi määrab eeskätt agregeerumine. Tugev hape või alus, värvitu leukovormi tekitavad redoksreaktsioonid ning seondumine valkude ja osakestega lisavad kõik monomeeri-dimeeri paarist erinevaid olekuid. Kui spekter muutub pärast puhvri lisamist, kontrollige enne kogu muutuse omistamist ainult pH-le, kas puhver sisaldab sooli või seonduvaid komponente. Keemiat ja protoneerumist käsitlev võrdlusmaterjal hoiab need keemilise vormi küsimused lahus siin käsitletavast agregeerumise küsimusest.

Miks Beer-Lamberti sirge kõverdub

Beer-Lamberti seose järgi võrdub neelduvus neeldumisteguri, kontsentratsiooni ja optilise tee pikkuse korrutisega. See on loendamisel põhinev seadus. See eeldab, et loendatavad objektid jäävad nende arvu muutudes samaks: üks neelav keemiline vorm, muutumatu spekter, kontsentratsioonist sõltuvate keemiliste muutuste puudumine, monokromaatne mõõtevalgus, hajumise ja taasemissiooni puudumine ning valgus, mis läbib tegelikult määratud optilise tee.

Agregeerumine rikub esimest eeldust. Formaalselt jääb koguneelduvus eri keemiliste vormide panuste summaks: optilise tee pikkus korrutatakse iga vormi neeldumisteguri ja selle vormi kontsentratsiooniga. Iga vorm järgib seadust. Segu seda ei tee, sest üksikute vormide kontsentratsioonid sõltuvad värvaine üldkontsentratsioonist mittelineaarselt. Monomeeri neeldumisribal mõõdetud neelduvuse kalibreerimiskõver värvaine üldkontsentratsiooni suhtes algab seetõttu tugevalt lahjendatud piirkonnas sirgena ja kõverdub kontsentratsiooni suurenedes allapoole, sest iga lisatud kogus annab proportsionaalselt vähem monomeeri. Dimeeri neeldumisribal mõõdetud kõver paindub vastassuunas. Agregeerumise uuringutes tuuakse just see mehhanism esile täheldatud Lambert-Beeri kõrvalekallete põhjusena. Tüüpiline viga on sobitada kõverdunud piirkonda sirge ja seda ekstrapoleerida. Sirge kehtib ainult selles vahemikus ja maatriksis, kus see koostati.

Lahjendamisega kaasneb samalaadne lõks. Kontsentreeritud põhilahuse lahjendamine instrumendi mõõtevahemikku jõudmiseks ei säilita keemiliste vormide suhet. Lahjendatud lahus küvetis tasakaalustub uuesti monomeeri suunas, mistõttu selle spekter kirjeldab õigesti lahjendatud proovi, kuid valesti põhilahust. Põhilahuse spektri tagas arvutamine neelduvusi üles skaleerides taastab üldsisalduse hinnangu ainult siis, kui kalibreerimine juba arvestab selle nihkega. Algset neeldumisribade kuju see ei taasta kunagi. Kontsentraadi spektri võrdlemine lahjendatud võrdluslahuse omaga tähendab kahe erineva koostisega segu võrdlemist.

Optilise tee pikkus on osa tulemusest

Neelduvus suureneb võrdeliselt teepikkusega, mille valgus proovis läbib. Sama lahusega täidetud 10 mm küvett annab kümme korda suurema neelduvuse kui 1 mm küvett. See skaleerimine on täpne ainult sama lahuse korral ning agregeerumise tõttu on see täpsustus määrava tähtsusega.

Praktikas on optilise tee pikkus vahend kehtivas mõõtevahemikus püsimiseks. Pikk optiline tee annab tundlikkuse lahjade, valdavalt monomeersete lahuste mõõtmiseks. Lühike optiline tee hoiab kontsentreeritud proovi mõõteskaalal ilma suure lahjendamiseta, mis tasakaalu uuesti paika seaks. Eespool toodud arvude aluseks olnud agregeerumise uuringus kasutati just seda lähenemist: 1 sentimeetri pikkuse optilise teega küvette värvainekontsentratsioonide 1.1 kuni 34 mikromolaarset jaoks ning 0.01 sentimeetri pikkuse optilise teega küvette vahemikus 94 mikromolaarsest kuni 3.4 millimolaarseni. Mikromahu mõõtealused ja mikroplaadilugejad lisavad oma geomeetria: lühikesed ja mõnikord muutuvad optilised teed ning pinnad, millele katioonne värvaine võib adsorbeeruda. Esitage optilise tee pikkus koos mõõtetulemusega, samamoodi nagu spektraalne võrdlusmaterjal esitab lahusti ja soola. Neelduvus ilma optilise tee pikkuseta ei ole tulemus. See on kuulujutt.

Mõõtmise korrektsuse nõuded tulenevad sellest mehhanismist. Laske proovidel enne mõõtmist sama temperatuuriga tasakaalustuda. Kasutage sama tüüpi ja sama orientatsiooniga küvette, sama soola- ja puhvritaustaga blankproove ning puhtaid laborinõusid, sest metüleensinine adsorbeerub klaasile ja plastile ning värvunud küvett kannab mälestust viimasest kontsentreeritud proovist. Kui agregeerumise kineetika on oluline, mõõtke peatselt pärast valmistamist ning koostage iga kalibreerimiskõver samas maatriksis ja sama optilise tee pikkusega nagu tundmatud proovid. Visuaalsel kontrollimisel pidage meeles, et silm on kehv spektromeeter. Küsimus, kas lahuse värv võimaldab määrata puhtust, on eraldi küsimus, mille vastus on eitav. Agregeerumisest tingitud värvitooni muutused on selle üks põhjus.

Skeem instrumendi kõrvale

Allolev joonis võtab artikli kokku üheks laborilaual kasutatavaks võrdlusmaterjaliks. Kolm lahust sisaldavad sama värvainet, kuid erinevad üldkontsentratsiooni ja soolatausta poolest. Nende skemaatilised spektrid näitavad, kuidas pika lainepikkuse monomeeririba osakaal väheneb lühema lainepikkuse dimeeririba kasuks, kui virnastumine suureneb. Tingimused on joonisel kirjas, sest ilma nendeta ei saa kõveraid uuesti kasutada. Kindlates tingimustes mõõdetud neeldumisribade asukohtade jaoks kasutage spektraalset võrdlusmaterjali. Selle kohta, kuidas värvaine pärast lahustumist rakkudesse siseneb, vt rakkudesse sisenemine redutseerumise ja jaotumise kaudu. Selle kohta, kuidas valgusdoos ja geomeetria fotokeemilisi mõõtetulemusi veel mõjutavad, vt valgusega kokkupuude ja mõõtmisgeomeetria.

Meeldejääval reeglil on kaks poolt. Spekter kirjeldab küvetis määratud tingimustel esinevat segu. Neelduvuse teisendab üldkontsentratsiooniks ainult kalibreerimine, mis on tehtud täpselt samades tingimustes.