Metüleensinise alternatiivid mikroskoopias

Lihtsa bakteripreparaadi puhul võib metüleensinise asendada kristallvioletiga, kui eesmärk on näha rakkude kuju. Elusrakkude puhul võib parem alternatiiv olla faasikontrast ilma värvaineta. Valik sõltub sellest, millist vaatlust on vaja teha.

Oletame, et kaks inimest uurivad sama bakterikultuuri. Üks soovib eristada pulgakujulisi rakke ümaratest rakkudest. Teine soovib teada, kas töötlemine on bakterid hävitanud. Värvaine, mis annab esimesele inimesele selge kujutise, ei pruugi anda teisele kasutatavat vastust.

Enne asendaja valimist lõpetage see lause: „Pean vaatlema ___ proovis ___ ning rakud peavad / ei pea jääma elusaks.” See lause määratleb ülesande, mida värvaine peab täitma.

Alustage proovist ja küsimusest

Kõigepealt otsustage, kas rakud peavad jääma elusaks, seejärel määrake, millist tunnust peate vaatlema:

Rakud peavad jääma elusaks: liikumise või kuju vaatlemiseks kaaluge värvimata faasikontrasti või DIC-d; tuuma-DNA puhul kaaluge Hoechst 33342 kasutamist fluorestsentsmikroskoopias; membraani terviklikkuse hindamiseks valige valideeritud analüüs, näiteks SYTO 9 koos propiidiumjodiidiga.
Rakud ei pea jääma elusaks: bakterite morfoloogia vaatlemiseks kaaluge kristallvioletiga lihtvärvimist või nigrosiiniga negatiivvärvimist; Grami reaktsiooni jaoks kasutage täielikku Grami värvimise meetodit; fikseeritud rakkude tuuma-DNA puhul kaaluge DAPI-fluorestsentsi.

Kasutage seda tabelit iga haru piirangute võrdlemiseks. Need on meetodivalikud, mitte juhised olemasolevas protokollis pudelite omavaheliseks asendamiseks.

Mida peate vaatlema	Proov ja seadmed	Võimalik alternatiiv	Peamine piirang
Bakterite kuju ja paigutus	Ettevalmistatud bakteripreparaat; heleväljamikroskoopia	Kristallvioletiga lihtvärvimine	Näitab morfoloogiat; ei määra Grami reaktsiooni ega eluvõimelisust.
Rakkude piirjooned tumedal taustal	Bakterioloogiline preparaat; heleväljamikroskoopia	Nigrosiiniga negatiivvärvimine	Preparaadi valmistamine ja koostis on olulised; värvimata rakk ei ole tingimata elus.
Grami reaktsioon	Ettevalmistatud bakteripreparaat; heleväljamikroskoopia	Täielik Grami värvimise meetod	Nõuab kogu reagendijärjestust ja kontrolle.
Liikumine või muutused elusrakkudes	Sobiv märgpreparaat; faasikontrast või DIC	Värvaineta	Nõuab sobivat optikat; kontrast ei tuvasta konkreetset molekuli.
Tuuma-DNA	Fikseeritud rakud; fluorestsents	DAPI	Nõuab sobivaid ergastus- ja emissioonifiltreid.
Tuuma-DNA elusrakkudes	Elusrakud; fluorestsents	Hoechst 33342	Rakku sisenemine ei tõenda, et kuvamistingimused on kahjutud.
Bakterimembraani terviklikkus	Fikseerimata bakterid; fluorestsents	SYTO 9 koos propiidiumjodiidiga	Membraani värvumine on eluvõimelisuse kaudne näitaja.

Lihtsa preparaadi puhul asendage meetod ettevaatlikult

Kristallviolett on praktiline valik, kui ülesanne on saada bakterite morfoloogiast ühevärviline kujutis. FDA Bacteriological Analytical Manual loetleb kaks lihtvärvimiseks sobivat kristallvioleti koostist. Kasutage dokumenteeritud koostist ja selle valmistamismeetodit; ainult värvaine nimetus ei määra kasutusvalmis reagenti.

Kristallvioletti kasutatakse ka Grami värvimisel, kuid see ei muuda kristallvioletiga lihtvärvimist Grami värvimiseks. ASM-i Grami värvimise protokollis sõltub diferentseeriv tulemus kristallvioleti, joodi, värvieemalduse ja vastuvärvimise järjestikusest toimest. Nende etappide väljajätmine muudab seda, mida kujutise põhjal saab järeldada. Selle erinevuse kohta vt lihtvärvimine võrreldes Grami värvimisega.

Nigrosiin võimaldab piirjooni esile tuua teisel viisil: see muudab tausta tumedaks, samal ajal kui bakterirakud jäävad võrdlemisi heledaks. Mercki nigrosiini juhendis on oluline detail, mis võib üldisest asendajate loetelust välja jääda. Selle määratud töölahus sisaldab formaldehüüdi. Seetõttu ei saa sõnade „negatiivvärvimine” põhjal järeldada sobivust elusrakkudele, kuigi rakud ise näivad värvimata. Kontrollige täielikku koostist ja proovi ettevalmistust.

Elusproovide puhul kaaluge optika muutmist

Kui soovite jälgida rakkude liikumist või jagunemist, võib teise värvaine lisamine vaatlust keerulisemaks muuta. Nagu Nikon selgitab oma juhendis läbipaistvate proovide kontrasti kohta, muudavad faasikontrast ja diferentsiaalne interferentskontrast ehk DIC proovid nähtavaks nende optiliste omaduste erinevuste kaudu. Nendega saab vaadelda elusaid värvimata rakke, kui mikroskoobil on vajalikud komponendid.

See valik säilitab värvimata preparaadi, kuid muudab saadava teabe olemust. Võite jälgida piiri või liikumist, teadmata, milline molekul kontrasti tekitas. Kui küsimus puudutab molekuli lokaliseerimist, valige selle asemel sobiv märgistamismeetod.

Tuuma-DNA puhul eristab Invitrogeni DAPI ja Hoechsti värvainete võrdlus DAPI tavapärast kasutamist fikseeritud rakkudega rakke paremini läbivast Hoechst 33342-st, mida eelistatakse elusrakkude märgistamiseks. Mõlemad nõuavad fluorestsentsseadmeid. Kumbki ei ole värvilise heleväljavärvingu otsene asendaja.

Käsitlege kokkupuudet värvainega ja valgustust katsetingimustena. Kui mõõdate rakkude käitumist, võrrelge värvitud ja värvimata preparaate.

Punane rakk ei ole automaatselt surnud rakk

SYTO 9 ja propiidiumjodiidi kasutatakse sageli koos bakterimembraani terviklikkuse hindamiseks. BacLighti juhend seostab terviklikud membraanid rohelise ja kahjustatud membraanid punase värvumisega. Seda tõlgendust tuleb konkreetse proovi jaoks valideerida.

Rosenbergi ja kolleegide 2019. aasta uuring illustreerib probleemi. Fosfaatpuhverdatud soolalahuses klaasil kasvatatud 24-tunnistes E. coli biokiledes näis umbes 96% rakkudest in situ propiidiumjodiid-positiivsed. Autorite hinnangul oli pärast kogumist siiski 82% rakkudest kultiveeritavad. Konfokaalkujutistel oli näha rohelise sisemusega rakke punaselt värvunud materjali all, mis viitas sellele, et eksitava signaali põhjustasid rakuvälised nukleiinhapped.

Need protsendid kirjeldavad uuringu preparaatidel tehtud eri mõõtmisi, mitte universaalset paranduskoefitsienti. Oluline järeldus on kontrollida, mis signaali tekitas. Biokiles võib nukleiinhappevärv tuvastada nii rakkudest väljaspool olevat materjali kui ka kahjustatud rakkudes olevat materjali. Eluvõimelisuse kohta järelduse tegemiseks soovitavad teadlased täiendavaid mõõtmisi, näiteks kultiveerimist või metaboolse aktiivsuse hindamist, tunnistades samal ajal, et igal meetodil on piirangud.

Kontrollige, mida alternatiiv tegelikult sisaldab

Alternatiivne värvimismeetod võib siiski sisaldada metüleensinist. Giemsa on üks näide: Merck kirjeldab oma toodet kui asuur-eosiin-metüleensinise lahust, mis on mõeldud muu hulgas vere- ja luuüdipreparaatide jaoks. See võib olla teistsugune meetod teistsuguse proovi jaoks, kuid ei vasta nõudele metüleensinine välistada.

Kui ühendi välistamine on katse osa, kontrollige enne kujutiste võrdlemist reagendi identiteeti ja koostist. Juhend metüülsinise, metüleensinise ja sarnase nimega värvainete kohta käsitleb nimetuste erinevusi.

Kontrollige asendust enne tulemuse kasutamist

Uue meetodi puhul tehke representatiivsete proovide ja sobiva kontrolliga väike võrdlus. Hoidke mikroskoobi seadistused võimaluse korral võrreldavana. Dokumenteerige reagendi koostis, proovi ettevalmistus, kokkupuude ja kuvamistingimused, et parema välimusega kujutist saaks uurida, mitte lihtsalt eelistada.

Hinnake tulemust algse küsimuse põhjal. Morfoloogia puhul hinnake, kas rakkude piirid ja paigutus jäävad tõlgendatavaks. Tuumade märgistamise puhul hinnake signaali asukohta ja tausta. Eluvõimelisuse puhul nõudke tõendusmaterjali, mis läheb kaugemale atraktiivsest värvieristusest. Laiem juhend metüleensinisega värvimise ja laboratoorsete rakenduste kohta selgitab, kuidas vaatlus ja preparaadi ettevalmistus omavahel seostuvad.

Valige alternatiiv, mis säilitab vajaliku mõõtmise. Värvus on saadud kujutise ainult üks omadus.