Metüleensinine ja nägemine: mida võrkkestauuringud näitavad ja kus nende piirid kulgevad

Lugeja leiab uuringu, milles metüleensinine kaitses võrkkesta, ja esitab loomuliku küsimuse: kas seda peaks silma panema? Metüleensinise ja nägemise uuringud sellele küsimusele ei vasta, sest ükski peamistest uuringutest ei katsetanud sellist kasutust. Ühes süstiti värvainet koos toksiiniga hiirte klaaskehasse. Teises lisati seda söötmesse, milles paiknesid katseanumas eraldatud rakud. Kolmandas pandi seda mutantsete hiirte joogivette. Iga tulemus kehtib oma manustamisviisi ja mudeli kohta.

Artikkel käsitleb kolme prekliinilist uuringut, kahte võrkkesta rakutüüpi ning piiri laboratoorsetes tingimustes täheldatud kaitse ja kliinilise silmaravi vahel. Ühine muster on selge: metüleensinine võib kontrollitud tingimustes muuta võrkkestarakkude mitokondriaalset stressi, kuid see leid ei õigusta jaemüügilahuste silma kandmist.

Kaks rakutüüpi, kaks erinevat haigust

Võrkkest koosneb kihtidest ning kihil on tähtsus. Valgus langeb kõigepealt võrkkesta välimise osa fotoretseptoritele. Nende signaalid liiguvad vaheneuronite kaudu võrkkesta sisemise osa ganglionirakkudeni, mille aksonid väljuvad nägemisnärvi kaudu. Alloleval skeemil on kihid nimetatud nende paiknemise järjekorras.

Glaukooma ja nägemisnärvi neuropaatia korral on ohus võrkkesta ganglionirakud. Kui otsingutes mainitakse metüleensinist ja glaukoomat, peetakse tavaliselt silmas seda sisemist kihti ja selle aksoneid. Võrkkesta välimise osa degeneratsiooni korral on ohus fotoretseptorid. Nende energiavajadus on võrkkestas kõige suurem ja nende rakuhingamine töötab oma võimekuse piiri lähedal, mistõttu jääb mitokondriaalse kompleksi I talitlushäire korral vähe varu. Ühe rakutüübi kohta saadud tulemus ei ole teisele ülekantav ning allpool kirjeldatud kolm uuringut käsitlevad neid eraldi. Mudelite ja järelduste eristamise üldpõhimõtteid selgitab artikkel kuidas lugeda metüleensinise uuringuid.

Ganglionirakud elava hiire silmas

Neist kolmest uuringust varaseimas modelleerisid teadlased nägemisnärvi neuropaatiat, mikrosüstides rotenooni hiire ühe silma klaaskehasse, ning kasutasid teist silma kandjalahuse kontrollina. Rotenoon blokeerib mitokondriaalse kompleksi I ehk sisenemispunkti, mis kannab elektronid NADH-lt edasi. Kompleksi I talitlushäire seob seda mudelit ka Leberi päriliku nägemisnärvi neuropaatiaga, mis on ganglionirakkude ja nägemisnärvi haigus.

Kakskümmend neli tundi hiljem oli rotenooniga töödeldud silmade ganglionirakkude kiht õhem ja sisaldas vähem rakke kui kontrollsilmades. Kui metüleensinine süstiti koos rotenooniga, hoidis see kahjustuse ära annusest sõltuvalt: suurim katsetatud annus (0.07 mg/kg, hiire LD50-st märksa väiksem) säilitas nii kihi paksuse kui ka rakkude arvu. Paralleelsed katsed ajuhomogenaatidega näitasid kahte mõju: metüleensinine pööras tagasi rotenooni põhjustatud oksüdatiivse stressi ja hapnikutarbimise vähenemise. Autorid pakkusid välja eksitotoksilise mehhanismi, mille korral rotenoon kahjustab moduleerivaid amakriinrakke, ganglionirakkude aktiivsus muutub ülemääraseks ning antioksüdantne toime katkestab sellest tuleneva kahjustuse. Selle kaitse võimalikku keemilist alust käsitleb üksikasjalikult artikkel metüleensinise mitokondriaalsed mehhanismid.

Selle tulemusega kaasneb kolm piirangut. Värvaine süstiti koos toksiiniga otse silma: see on manustamisviis, mitte raviskeem. Vaatlusperiood kestis 24 tundi. Lisaks suurenesid tsütokroomoksüdaasi näitajad mõlemas kahjustatud rühmas, mida autorid tõlgendasid liigse aktiivsusena, mitte tõendina rakuhingamise taastumisest elavas võrkkestas.

Katseanumas eraldatud ganglionirakud

Teises uuringus silma tervikuna üldse ei kasutatud. Teadlased eraldasid noortelt rottidelt primaarsed võrkkesta ganglionirakud ja mõjutasid neid rotenooni, apoptoosi indutseeriva staurosporiini või 72 tundi kestnud hapnikuvaegusega, seejärel mõõtsid elulemust elusate ja surnud rakkude eristusvärvinguga. Metüleensinine söötmes kontsentratsioonidel 1 ja 10 micromolar parandas elulemust iga kahjustava teguri korral, olenevalt tingimustest ligikaudu 1.5 kuni 1.9 korda. Kaasnevas katses säilitas metüleensinine tsütokroom c oksüdaasi aktiivsuse vesinikperoksiidiga kokkupuutel.

See on eraldatud rakkude farmakoloogia. Ühend jõudis rakkudeni difusiooni teel läbi kindla kontsentratsiooniga söötme, ilma et teele oleks jäänud sarvkest, pisarakile, lääts, klaaskeha, verevarustus või immuunsüsteem. Mudeli eesmärk ongi selline lihtsus: see näitab, et ganglionirakke endid saab kaitsta, kui ühend nendeni jõuab. See ei ütle midagi selle kohta, kas sarvkesta pinnale kantud tilk viiks võrkkesta sisemisse ossa mingi kindla kontsentratsiooni. Kontsentratsioone üle 10 micromolar välditi nende toksilisuse tõttu samadele rakkudele — see tuletab meelde, et katseanumas võib annuse muutmine mõjutada tulemust mõlemas suunas.

Fotoretseptorid mutantsetes hiirtes ja rakuliinis

Kolmas uuring käsitleb võrkkesta välimist osa. Teadlased kasutasid Harlequin-hiiri, kelle apoptoosi indutseeriva faktori puudulikkuse tõttu jääb kompleks I mittetäielikult kokku panduks, ning uurisid 11 kuu vanuses fotoretseptorite struktuuri, välissegmentide markereid ja mitokondrite terviklikkust. Metüleensinist manustati pärast võõrutamist süsteemselt joogivees ligikaudu 10 mg/kg päevas. Ravitud mutantidel säilis võrreldes ravimata mutantidega suurem võrkkesta paksus, rohkem rodopsiini ja opsiini markereid ning tervem mitokondrite struktuur.

Kaasnevas rakukatses kasutati 661W-rakke, immortaliseeritud hiire fotoretseptorisarnast rakuliini, mida mõjutati 24 tundi rotenooniga kas metüleensinise juuresolekul või ilma selleta. Elulemus paranes kontsentratsioonil 30 micromolar ning väiksemad kontsentratsioonid normaliseerisid NADH ja NAD+ suhte ning vähendasid oksüdatiivset stressi. Tähelepanuväärne on see, mida metüleensinine ei teinud: see ei taastanud ATP-d. Kaitse oli seotud redoksstressi leevenemise ja stressiradade aktiivsuse vähenemisega, sealhulgas mitokondriaalse voltumata valkude vastuse ning mitofaagia markerite puhul, mitte energiavarustuse taastumisega.

See eristus on oluline metüleensinise ja võrkkesta kohta esitatavate väidete hindamisel. Ühend võib hoida stressis fotoretseptori elus ilma selle energiadefitsiiti kõrvaldamata, mis piirab võimaliku ravialase tõlgenduse redoksstressiga, mitte laialdase noorendava toimega.

Kolm uuringut kõrvuti

Allolevas võrdluses on iga uuring esitatud mudeli ja manustamisviisi järgi, sest just need kaks veergu määravad, milliseid järeldusi tulemus toetab.

Kõik read kirjeldavad prekliinilisi uuringuid. Üheski ei kaasatud patsiente, mõõdetud nägemist ega katsetatud silmaravimvormi.

Miks see ei ole glaukoomaravi

Glaukoomaravi alandab silmasisest rõhku. Neuroprotektsiooni eesmärk on teine: hoida ganglionirakud ja nende aksonid stressi tingimustes elus. Eespool kirjeldatud uuringud kuuluvad teise, mitte esimesse valdkonda. Ükski neist ei alandanud rõhku ega võrrelnud metüleensinist rõhku alandava raviga. Seetõttu jäävad väljakujunenud glaukoomaravi ja rõhu kontrolli meetodid redoksneuroprotektsioonist eraldi küsimuseks ning rakkude elulemuse tulemust ei saa tõlgendada nägemise säilimisena.

Manustamisviiside erinevused rõhutavad seda veelgi. Koossüstimine klaaskehasse viib teadaoleva koguse kahjustuse tekkimise hetkel võrkkesta kõrvale. Joogiveega manustamine avaldab kuude jooksul mõju kogu loomale, kusjuures kontsentratsioon võrkkestas on teadmata. Söötmes puutuvad eraldatud rakud ühendiga vahetult kokku. Ükski neist viisidest ei ennusta, milline osa paikselt manustatud annusest läbiks sarvkesta, väldiks pisaratega eemaldumist, läbiks läätse ja klaaskeha ning jõuaks kummassegi võrkkestakihti kasuliku kontsentratsioonina. See kohaletoimetamise probleem on osa laiemast küsimusest, mida käsitleb artikkel metüleensinise manustamisviisid ja jaotumine: iga manustamisviisi puhul on vaja eraldi kontsentratsioonimõõtmisi.

Kudede erinevused lisavad teise takistuse. Silma eesmisse ossa jõudnud värvaine ei ole veel jõudnud selle tagumisse ossa ning üht kihti toetav kontsentratsioon võib teist kahjustada. Jaemüügilahuseid ei toodeta, steriliseerita, puhverdata ega konserveerita silmapreparaatidele kehtivate nõuete järgi ning puhtus, pH, osmolaalsus ja abiained on kõik olulised nii sarvkesta kui ka silmasisese kokkupuute puhul. Ükski neist võrkkestauuringute tulemustest ei kinnita selliste lahuste silma sisse või pinnale kandmise sobivust. Preparaatide standarditega seotud küsimused kuuluvad metüleensinise ohutuse ja käitlemise valdkonda.

Kus tõendusmaterjali piir kulgeb

Koos käsitletuna toetavad need kolm artiklit kitsast väidet: kontrollitud tingimustes võib metüleensinine leevendada võrkkesta neuronite mitokondriaalset redoksstressi ja säilitada nende struktuuri. Väide kehtib vaid nende tingimuste piires. Toksiini- ja geneetilise kompleksi I mudelid ei ole glaukooma, druusid ega diabeetiline haigus. Lühikesed vaatlusperioodid ja struktuursed tulemusnäitajad ei tähenda nägemise pikaajalist säilimist. Ning ühes koeruumis kaitsev kontsentratsioon ei ole teise jaoks sobiv annus.

Tugevama tõenduse jaoks oleks vaja eraldi osi: määratletud kokkupuudet võrkkestas pärast kliiniliselt kasutatavat manustamisviisi, funktsionaalseid nägemise tulemusnäitajaid loomadel, rõhust sõltumatut kasu glaukooma seisukohalt asjakohases mudelis ning seejärel ohutus- ja efektiivsusandmeid inimestelt. Kuni neid pole, jääb metüleensinise ja nägemise seos selgete piiridega uurimishüpoteesiks: usutav mitokondriaalne farmakoloogia võrkkestas, mida on näidatud ainult rakkudes ja loomadel, ilma et neist uuringutest viiks tee silmade ravimiseni.