Kas metüleensinine saab mitokondriaalsest kompleksist III mööduda? Miks uuringud lahknevad

Kaks laborit uurisid, kas metüleensinine saab blokeeritud mitokondriaalsest kompleksist III mööduda. Üks vastas ei. Teine vastas jah. Mõlemal olid andmed.

Esimene uuring hiire aju mitokondritega leidis, et värvaine seda ei suuda. Teine, kolme näriliseliigi aju mitokondritega tehtud uuring leidis, et osaliselt suudab. Kolmandale, hiire maksaga tehtud uuringule viidatakse sageli samas kontekstis, kuid see uuris midagi muud. Kui käsitleda seda õiges kontekstis, kaob pool segadusest.

Üht universaalset mehhanismi siin välja kuulutada ei saa. On kolm katset erinevate blokaatorite, annuste ja mõõdetavate näitajatega. Loe kõigepealt tingimusi. Järeldused tulenevad neist.

Mida möödaviik siin tähendab

Elektronid sisenevad ahelasse kompleksi I kaudu (NADH-st) või kompleksi II kaudu (suktsinaadist), liiguvad läbi kompleksi III tsütokroom c-ni ja seejärel läbi kompleksi IV hapnikuni. Selle käigus tekkivat gradienti kasutab rakk ATP tootmiseks.

Möödaviigu väide tähendab, et metüleensinine võtab elektronid vastu enne blokeeritud kohta ja annab need edasi sellest allpool. Oksüdeeritud värvaine võtab elektronid NADH-lt või ahela varasematelt komponentidelt, muutudes leukometüleensiniseks, ning redutseeritud vorm annab need tsütokroom c-le või tagasi ahelasse. Kui elektronid antakse üle blokeeritud kohast allpool, taastuvad hingamine ja membraanipotentsiaal osaliselt. Kui üleandmine toimub blokeeritud kohas või sellest eespool, ei taastu midagi.

Suur osa sellest vaidlusest sõltub kompleksi III ühest üksikasjast. Kompleksis toimub Q-tsükkel, millel on kaks inhibiitorite seondumiskohta. Antimütsiin seondub Qi-kohaga. Müksotiasool seondub Qo-kohaga. Uuring, milles kasutatakse neist ainult üht, on kontrollinud vaid poolt kompleksist.

Esimene uuring: hiire aju mitokondrites möödaviiku ei ole

Gureev ja kolleegid kasutasid C57BL/6 hiirte ajukoore mitokondreid, mis isoleeriti digitoniiniga ja mida analüüsiti valgukontsentratsioonil 0.1 mg ml kohta. Substraate kasutati kolmes kombinatsioonis: püruvaat ja malaat, mõlemad 5 mM; suktsinaat 10 mM koos glutamaadiga 2 mM; ning L-proliin 10 mM. Blokaatoriteks olid rotenoon kontsentratsioonil 1 mikromolaarne (kompleks I) ja antimütsiin kontsentratsioonil 1 mikrogramm ml kohta (kompleks III). Värvaine kontsentratsioonid olid 0.5, 1 ja 2 mikromolaarsed, põhikontsentratsiooniga 1 mikromolaarne. Meetodid ja mõõtekõverad on esitatud FEBS Lettersi lühiteates.

Möödaviik kompleksist I toimis. Rotenoon vähendas ADP-ga stimuleeritud hingamise ligikaudu 121-lt ligikaudu 2 nmol-ni minutis mg kohta ning värvaine kontsentratsioonil 1 mikromolaarne taastas selle ligikaudu 21-ni. Membraanipotentsiaal taastus nii püruvaadi ja malaadi kui ka L-proliini kasutamisel.

Möödaviik kompleksist III ei toiminud. Antimütsiin vähendas hingamise ligikaudu 16-ni ning värvaine tõstis selle vaid ligikaudu 20-ni. Membraanipotentsiaal ei taastunud ühegi substraadiga ka värvaine kontsentratsioonidel kuni 5 mikromolaarne. Peroksiidiandmed osutasid samale: värvaine üksi suurendas peroksiidi eraldumise baaskiirust ligikaudu 76 pmol-lt minutis mg kohta kolme kontsentratsiooni juures vastavalt ligikaudu 1170, 1460 ja 1945-ni, kuid antimütsiin vähendas seda värvaine tekitatud signaali vastavalt ligikaudu 25, 88 ja 96 protsenti. Kui redutseeritud värvaine reageeriks otse hapnikuga, ei tohiks kompleksi III blokeerimine signaali pärssida. Autorid järeldasid, et redutseeritud värvaine oksüdeerub kompleksi III Qo-kohas, enne antimütsiini blokeeritud kohta. Lühike ring sõnades: doonoritelt värvainele, värvainelt Qo-kohale, sealt edasi tavapärast rada pidi. Rotenoonist möödutakse. Antimütsiinist mitte.

Teine uuring: osaline möödaviik kolmel liigil, mõlema inhibiitori seondumiskoha korral

Svab ja kolleegid laiendasid katse ülesehitust. Nad kasutasid hiirte, rottide ja merisigade aju mitokondreid, mis isoleeriti Percolliga ja mida analüüsiti samal kontsentratsioonil 0.1 mg ml kohta, substraatideks püruvaat ja malaat või glutamaat ja malaat, igaüks 5 mM. Nad kasutasid kaht kompleksi III blokaatorit: antimütsiin A kontsentratsioonil 0.3 mikromolaarne ja müksotiasool kontsentratsioonil 1 mikromolaarne. Värvaine kontsentratsioon oli enamikus analüüsides 2 mikromolaarne, tsütokroom c katsetes 0.5. Kõigi kolme liigi ühtlustatud protokollidega katsed on esitatud avatud juurdepääsuga artiklis.

Mõlemast blokeeritud kohast mööduti osaliselt kõigil kolmel liigil. Hiire mitokondrites pärssis antimütsiin hingamist ja värvaine suurendas seda ligikaudu 60 protsenti, umbes 37-lt 59 nmol-ni minutis mg kohta. Müksotiasool pärssis hingamist 88 protsenti, ligikaudu 4.5-ni, ning värvaine suurendas seda viis korda, ligikaudu 23-ni. Membraanipotentsiaal repolariseerus osaliselt kummagi inhibiitori korral; optiliste artefaktide välistamiseks mõõdeti seda kahe värvainega (safraniin O ja suhtarvulisel mõõtmisel kasutatav TMRM).

Selles töös uuriti ka elektronide üleandmist otse, mida esimeses uuringus ei tehtud. Energiaga varustatud mitokondrid ei redutseerinud eksogeenset atsetüülitud tsütokroom c-d kontsentratsioonil 25 mikromolaarne ei inhibiitoritega ega ilma nendeta, kuid värvaine lisamine käivitas redutseerimise mõlemal juhul. Rakuvabas puhvris redutseeris NADH koos värvainega tsütokroom c-d kiirusega, mis oli võrdeline NADH kontsentratsiooniga. Pikem hüpe sõnades: redutseerivad ekvivalendid värvainele, värvainelt otse tsütokroom c-le, kompleksi IV kaudu hapnikule. See rada jätab kompleksi III täielikult vahele, mistõttu saab mõlemast blokaatorist mööduda.

Seda tõlgendust toetavad veel kaks mõõdetud näitajat. NAD(P)H fluorestsents vähenes, kui värvaine lisati müksotiasooliga töödeldud mitokondritele, mis tähendab, et redutseerivad ekvivalendid liikusid välja uue raja kaudu. Värvaine neeldumine lainepikkusel 660 nm peegeldas omakorda iga lisamist, samal ajal kui tsentrifuugitud proovide supernatandid näitasid, et oksüdeeritud värvaine kontsentreerus energiaga varustatud mitokondrites rohkem kui sajakordselt ja väljus neist potentsiaali kokkuvarisemisel. Ka prootonibilanss sobib selle selgitusega: prootonite pumpamise etappide vahelejätmisel jääb elektronipaari kohta ligikaudu 2 prootonit 10 asemel. Seega on kiirem hapnikutarbimine koos vaid osalise repolariseerumisega just see, mida tegelikult möödaviigult oodata, mitte tõend selle vastu.

Sama preparaat andis vastuseid, mille pealiskaudne tõlgendamine viib eksiteele. Inhibiitori ja värvaine koosmõjul vähendas ADP hingamist selle suurendamise asemel ning transpordi blokeerimine stimuleeris hingamist selle aeglustamise asemel, kuigi membraanipotentsiaal muutus endiselt tavapärastes suundades. Üksnes hapnikutarbimine on selles süsteemis eksitav.

Kolmas uuring: maksauuring, milles uuriti komplekse I ja II, mitte III

Lee ja Boelsterli kasutasid hiire maksa mitokondreid ning kultiveeritud hepatotsüüte, mida kahjustati efavirensi (kompleks I, IC50 ligikaudu 30 mikromolaarne) ja isoniasiidi metaboliidi hüdrasiiniga (kompleks II, IC50 ligikaudu 30 mikromolaarne). Värvaine kontsentratsioonil ligikaudu 30 mikromolaarne taastas NADH oksüdatsiooni, membraanipotentsiaali ja ATP taseme, vähendades samal ajal oksüdante ja nekrootilist rakusurma. Redox Biology artiklis esitatud mudeli järgi kannab värvaine elektrone kahjustatud kompleksidest I ja II mööda.

See tulemus kuulub kinnitatud teadmiste hulka ahela varasema osa kohta ega ütle midagi kompleksi III kohta, sest selles uuringus ei blokeeritud seal midagi. See ei saa kumbagi aju-uuringut kinnitada ega ümber lükata.

Tingimuste maatriks

Neli põhjust, miks mõlemal kompleksi III uuringul võib oma katsetingimustes õigus olla

1. Blokaatori kasutamine ei olnud sama sekkumine. Antimütsiin üksi kontsentratsioonil 1 mikrogramm ml kohta võrrelduna antimütsiiniga kontsentratsioonil 0.3 mikromolaarne ja eraldi Qo-koha blokaatoriga. Värvaine rada, mis suunab elektronid Qo-kohta, ebaõnnestub just seal, kus otse tsütokroom c-le suunduv rada toimib. Üks seondumiskoht ei saa esindada mõlemat.

2. Värvaine kontsentratsioon ja ajastus erinesid. Peamised kontsentratsioonid olid 1 ja 2 mikromolaarsed ning tegu on redokstsüklis osaleva ainega, mille sisenemine mitokondritesse ja tsütokroom c otsene redutseerimine sõltuvad kontsentratsioonist ja ajast. Väikesed kontsentratsioonierinevused koos erineva mõõtmisajastusega võivad tuua esile ühe võrgustiku eri harusid.

3. Preparaadid erinesid. Digitoniiniga isoleerimine ja Percolli gradiendiga isoleerimine valivad välja kattuvad, kuid mitte identsed mitokondripopulatsioonid. Valgukontsentratsioon oli mõlemal juhul 0.1 mg ml kohta, nii et see muutuja langeb välja, kuid alampopulatsioon ja terviklikkus mitte. Liigierinevuse kahtlus sai samuti kõrvaldatud: teine rühm kordas oma tulemust ka hiire mitokondrites.

4. Substraatide seisund määrab, mida värvaine saab teha. Kolm substraadirežiimi võrrelduna NADH-ga seotud substraadipaaridega. NADH kättesaadavus ja membraanipotentsiaal määravad koos, kui kiiresti värvaine redutseerub ja kuhu see jaotub. Rada, mis vajab redutseeritud värvainet oksüdeeritud tsütokroom c kõrval, sõltub sellest valikust.

Kuidas lugeda järgmist möödaviigu väidet

Küsi, milline kompleks blokeeriti, millise inhibiitoriga, millises kohas ja millisel kontsentratsioonil. Küsi värvaine kontsentratsiooni ja mõõtmise aega. Küsi koe, liigi, isoleerimismeetodi, valgukontsentratsiooni ja substraadi kohta. Ning küsi, kas potentsiaal, hingamine, redoksseisund ja otsese elektronide üleandmise katse annavad kooskõlalisi tulemusi, sest üksnes hapnikutarbimine osutas siin valele suunale rohkem kui korra.

Kitsas kokkuvõte peab paika. Värvaine möödaviigus kompleksist I ollakse ühel meelel. Kompleksi III puhul ei näita hiire mitokondrid funktsionaalset möödaviiku, kui antimütsiini kontsentratsioon on 1 mikrogramm ml kohta ja värvaine kontsentratsioon 1 mikromolaarne. Seevastu näitavad kolme liigi mitokondrid osalist möödaviiku koos elektronide otsese ülekandega värvainelt tsütokroom c-le, kui antimütsiini kontsentratsioon on 0.3 mikromolaarne või müksotiasooli kontsentratsioon 1 mikromolaarne ning värvaine kontsentratsioon 2 mikromolaarne. Need väited saavad kõrvuti kehtida. Kõik laiemad järeldused on ekstrapolatsioon.

Seotud lugemismaterjal aitab hoida vaidlusalust väidet vaieldamatu keemia raamides: kuidas metüleensinine elektrone liigutab selgitab elektronide vahendamist, kompleksi I möödaviigu katsed käsitlevad kinnitatud juhtumit ahela varasemas osas, membraanipotentsiaali mõõtmised ja nende artefaktid selgitavad, miks oli vaja kaht värvainet, ning redokstsüklis osalevate ainete käsitsemine laboris aitab mõista kontsentratsiooni ja ajastusega seotud lõkse.