Metüleensinine ja luustiku vananemine: miks rakukatsete tulemused ei ennustanud hiirte luudes toimuvat

Kujutage ette ühendit, mis vaigistab just neid rakke, mis luud lagundavad, ning toimib katseanumas täpselt nii, nagu loodeti. Vähem mitmetuumalisi osteoklaste, selge annusest sõltuv toime ja usutav mitokondritega seotud seletus. Seejärel antakse sama ühendit hiirtele suurema osa nende täiskasvanueast, nende luustikke skaneeritakse kolmemõõtmeliselt ning erinevust ei ole. Vananenud luud näevad välja vananenud, olenemata sellest, kas ühendit manustati või mitte.

Selline on ühe 2024. aasta uuringu aus kokkuvõte ning seda tasub täpselt mõista, sest just siin kulgeb murdejoon, millel enamik luudega seotud toidulisandiväiteid puruneb. Tegemist on Poudeli ja kolleegide artikliga, mis avaldati 2024. aasta märtsis ajakirjas Aging. Artikkel on avatud juurdepääsuga, seega saab kõiki allpool kirjeldatud mõõtmisi algallikast kontrollida. Selle põhitulemus on mõju puudumine. Mõju puudumine ei tähenda läbikukkumist. See on vastus ning see uuring vastab hästi ühele kitsale küsimusele: kas pikaajaline süsteemne antioksüdantne ravi metüleensinise või mitokinooniga säilitab vananeva hiire luustikku? Ei.

Kuidas luude vananemine arvudes välja näeb

Vanusega kaasnev luukadu ei ole üksainus nähtus, seega ei mõõdetud uuringus ainult ühte asja. Mikrokompuutertomograafia abil skaneerisid uurijad kolme luustiku piirkonda: kortikaalset luud reieluu diafüüsi keskosas ehk tihedas luuvarres, trabekulaarset luud reieluu distaalses metafüüsis ehk liigese lähedal asuvas käsnjas võrgustikus ning trabekulaarset luud viiendas nimmelülis. Igas piirkonnas registreeriti standardsed mikroarhitektuuri parameetrid. BV/TV näitab, kui suure osa mahust moodustab luu, mitte luuüdiruum. BMD on mineraalne tihedus. Tb.Th, Tb.N ja Tb.Sp kirjeldavad trabekulite paksust, arvu ja vahekaugust. Kortikaalse luu paksus ja ristlõikepindalad kirjeldavad luuvart.

Mõelge trabekulaarsest luust kui laos asuvast tugiraamistikust. Vananemine eemaldab mõned tugielemendid täielikult ja muudab ülejäänud õhemaks, mistõttu väheneb struktuuriga täidetud ruumi osakaal, allesjäänud tugielemendid paiknevad üksteisest kaugemal ning kogu raamistik kannab väiksemat koormust. Kortikaalne luu on lao sein ise, mis muutub õhemaks. Luustikku kaitsev ravi peaks kajastuma nendes arvudes. Just seda uuringus kontrolliti.

Mis juhtus katseanumas

Rakukatsetes kasutati luuüdi, mis võeti 6 kuni 7 kuu vanuste UM-HET3 hiirte reie- ja sääreluudest. See on vananemisuuringuteks aretatud geneetiliselt mitmekesine hiireliin. Katsetest saadi neli tulemust, mis osutavad eri suundadesse, seega väärib igaüks eraldi käsitlemist.

Esiteks säilis mesenhümaalsete tüvirakkude eluvõimelisus 48 tunni jooksul metüleensinise ja mitokinooni kontsentratsioonidel 0.125 kuni 0.5 mikromolaari. Nende tüvirakkude hulka kuuluvad ka tulevased luud moodustavad rakud. Ei toksilisust ega paranemist. Teiseks, kui need tüvirakud suunati osteogeenses söötmes osteoblastideks arenema ning 18. päeval värviti aluselise fosfataasi tuvastamiseks, ei muutnud kumbki ühend tulemust ühelgi uuritud kontsentratsioonil. Katseanuma luud moodustav pool ei reageerinud.

Kolmandaks reageeris luud resorbeeriv pool. Luuüdi eellasrakke stimuleeriti M-CSF-i ja RANKL-iga, mis on tavapärane osteoklastide tekitamise meetod. Kontsentratsiooni suurenedes moodustus vähem TRAP-positiivseid mitmetuumalisi rakke ning selge vähenemine ilmnes üle 0.25 mikromolaari, praktikas suurimal uuritud kontsentratsioonil 0.5. Just see tulemus annab tõuke lugematutele optimistlikele kokkuvõtetele ning oma piirides on see tõene: otsene pidev kokkupuude rakukultuuris pärssis osteoklastide teket annusest sõltuvalt.

Neljandaks ei näidanud küpsed osteoblastid pärast 48-tunnist kokkupuudet ja mitokondriaalse stressi testi kummagi ühendi korral olulist muutust basaalses ega maksimaalses hapnikutarbimises. Kontsentratsioonil 0.5 mikromolaari näisid mõlemad rakuhingamist veidi vähendavat, kuid muutus ei olnud statistiliselt oluline. Seega ei ilmnenud katseanumas luud moodustavate rakkude mitokondriaalse talitluse paranemist, mida saaks kõrvutada osteoklastide teket pärssiva toimega. Pakutud mehhanism, energiavahetuse paranemine mitokondriaalse elektronide transpordiahela kaudu, ei tekitanud mõõdetavat rakuhingamise paranemist seal, kus uurijad seda otsisid.

Mis juhtus hiirtega

Järgnes kaks väga erineva ulatusega loomkatset.

Väiksemas katses kasutati inbriidseid C57BL/6J emashiiri, kes esindavad biomeditsiinilistes uuringutes laialt kasutatavat hiireliini. Alates 18 kuu vanusest, mis vastab hiire puhul ligikaudu hilisele keskeale, jõi pool neist 250-mikromolaarset metüleensinist sisaldavat vett 6 või 12 kuud, kuni 24 või 30 kuu vanuseni. Ainet mitte saanud 18 kuu vanused emashiired andsid lähteväärtused ning 5 kuu vanused emashiired näitasid, milline näeb välja noor luu. Vananemine tegi täpselt seda, mida vananemine teeb. L5 selgroolülis vähenes luumahu osakaal umbes 35 protsenti, mineraalne tihedus umbes 18 protsenti ning trabekulite arv ligikaudu poole võrra, olenemata aine manustamisest. Kortikaalse luu paksus vähenes 18 ja 24 kuu vahel ligikaudu 10 protsenti ning 30 kuu vanuseks ligikaudu 30 protsenti. Metüleensinine ei muutnud ühegi sellise kõvera kulgu.

Suurem katse viidi läbi programmi National Institute on Aging Interventions Testing Program raames, kus uuritakse võimalikke sekkumisühendeid mõlemast soost UM-HET3 hiirtel kolmes uurimiskeskuses. Metüleensinise manustamist sisaldusel 28 miljondikosa söödas ja mitokinooni manustamist sisaldusel 100 miljondikosa alustati kummalgi juhul varases täiskasvanueas ning jätkati umbes 22 kuni 24 kuu vanuseni. Samad kolm luustiku piirkonda läbisid mikro-CT-uuringu. Avaldatud tabel esitab kõik parameetrid soo ja manustatud aine järgi koos korrigeeritud statistiliste analüüsidega ning manustamise mõju veerg ütleb läbivalt sama: mitte kusagil ei ilmnenud olulist mõju ega manustamise ja soo koostoimet. Kortikaalne või trabekulaarne luu, reieluu või selgroog, isane või emane, metüleensinine või mitokinoon — luustik vananes tavapärases tempos.

Mõlemat katsepoolt ühendav võrdlustabel

Sellel tabelil põhineb kogu artikkel. Iga rida kõrvutab sama bioloogilise protsessi puhul katseanumas ja loomas ilmnenud tulemusi, kasutades uuringu enda mõõtmisi.

Rida-realt lugedes kaotab tabel näilise vastuolu. Neljast rakuprotsessist reageeris ainult üks ning seegi üksnes uuritud vahemiku ülemise piiri lähedal pideva otsese kokkupuute korral. Kõiges muus puudus mõju juba katseanumas. Loomkatse tulemus näib siis vähem vastuolu ja rohkem kinnitusena: kolm mõju puudumist ning üks tingimuslik toime rakukultuuris kujunesid loomas läbivaks mõju puudumiseks.

Luustruktuur ei ole eluiga

Üks segadus väärib omaette jaotist, sest metüleensinisel on tõepoolest elueaga seotud uurimistulemusi ning neid on lihtne ekslikult pidada luudega seotud tulemusteks. Varasemas Interventions Testing Programi kohordis suurendas sama söödasisaldusega metüleensinine UM-HET3 emashiirte eluea 90. protsentiili umbes 6 protsenti. See oli hilises elueas avalduv elulemuse muutus, millega ei kaasnenud mediaaneluea muutust ega mõju isashiirtele. Mitokinoon ei mõjutanud kummagi soo eluiga. Need elulemuse arvud pärinevad programmi avaldatud pikaealisuse andmetest, mitte luu-uuringu artiklist.

Luu-uuringu artikli panus on hoida need arvestused lahus. Ühend võib muuta ühe soo hilise eluea elulemust, säilitamata ühtegi mõõdetud luustiku omadust. Elulemuse hindamisel loetakse kokku kõikidest põhjustest tingitud surmad; mikro-CT loendab selgroolüli tugielemente. Pole reeglit, et sekkumine peab elu pikendamiseks toimima luude kaudu, ning see uuring annab otsese tõendi, et metüleensinise hilise eluea toime emashiirtel avaldus mõne muu tee kaudu. Kes viitab eluea tulemusele kui toetusele metüleensinise kasutamiseks osteoporoosi korral, võtab raha valelt kontolt. Nende arvestuste lahushoidmise üldist põhimõtet käsitleb artikkel kuidas lugeda metüleensinise uuringuid.

Miks katseanum ei ennustanud hiire tulemust

Andmetega sobivad viis selgitust ning need ei välista üksteist.

Esimene on kokkupuude. Rakukultuuris viibisid rakud pidevalt teadaoleva kontsentratsiooniga lahuses. Hiired sõid ainet sisaldavat sööta kuid ning uuringus ei mõõdetud ei aine sisaldust luuüdis ega ühtegi luu oksüdatiivse kahjustuse markerit. Kontsentratsioon, mis otsesel kokkupuutel pärsib osteoklaste, ei pruugi luuüdi eellasrakkudeni kunagi samal tasemel jõuda. Artiklis uuriti in vivo kummagi ühendi puhul ühte annust, seega jääb annusest sõltuv toime loomas teadmata.

Teine on keemia. Reaktiivsed hapnikuühendid ei moodusta rakus üht ühtlaselt segunenud kogumit. Need toimivad väikestes rakusisestes piirkondades lühikeste ajavahemike jooksul ning mitokondriaalsed, tsütosoolsed ja membraanidega seotud redoksahelad käituvad osaliselt sõltumatult. Mitokinoon on kavandatud koonduma mitokondritesse, samal ajal kui osteoklastide teket käivitavad oksüdatiivsed signaalid võivad pärineda mujalt. Ühe kogumi vähendamine ei pruugi anda sama tulemust nagu kogu raku pidev kokkupuude ainega.

Kolmas on protsesside seotus. Elusas luus on resorptsioon ja moodustumine omavahel seotud: osteoklastid ja nende naaberrakud saadavad signaale, mis toovad luud moodustavaid rakke äsja resorbeeritud piirkonda. Osteoklastide tekke pärssimine ei lisa samaväärset kogust luud, sest see võib eemaldada ka signaalid, mis ehitajad kohale kutsuvad. Ainult eellasrakke sisaldav katseanum ei saa seda tagasisidet näidata. Luustik ei saa seda varjata.

Neljas on koormus. Osteotsüüdid tajuvad mehaanilist deformatsiooni ning määravad kogu luu ümberkujundamise tasakaalu. Kui loomad vananevad ja liiguvad vähem, nõrgeneb mehaaniline signaal ning järgneb luukadu hoolimata mõõdukast farmakoloogilisest mõjust ühele rakutüübile. Autorid ise nimetavad tõenäolisemaks mõjutusvõimaluseks kehalist liikumist ja anaboolset koormust. See on viisakas viis öelda, et luustik kuulab füüsikat rohkem kui redokskeemiat.

Viies on ajastus, kuid mööndusega. C57BL/6J katses alustati manustamist 18 kuu vanuses, kui märkimisväärne struktuurikadu oli juba toimunud, ning ükski resorptsiooni pärssiv aine ei saa taastada läbistatud ja kadunud trabekuleid ilma vastava luumoodustumise stiimulita. Ajastus ei saa aga olla kogu selgitus, sest Interventions Testing Programi katses alustati manustamist varases täiskasvanueas ning ka seal ei muutunud midagi. Hiline algus selgitab osa ühest katsest. Teisest ei selgita see midagi.

Mida see tähendab metüleensinise ja osteoporoosi kohta käivate väidete jaoks

Lugejale, kes hindab metüleensinist luude tervise või luustiku vananemise seisukohast, on praktiline järeldus lühike. Parimad olemasolevad pikaajaliste hiireuuringute andmed ei näita metüleensinise ega mitokinooni pidevast manustamisest luustikule kasu, hoolimata tõelisest osteoklastide teket pärssivast toimest rakukultuuris. Eluea-alane kirjandus näitab metüleensinise tagasihoidlikku hilise eluea toimet ainult emashiirtel, kuid selle uuringu järgi ei avaldunud see luude kaudu. Kumbki andmestik ei toeta kasutamist inimestel osteoporoosi korral ning inimeste luuandmeid ei ole selles käsitluses üldse. Inimeste annustamise ja tooteohutuse küsimused kuuluvad artiklisse metüleensinise ohutus ja kõrvaltoimed, mitte selle hiireluustiku juurde.

Sügavam õppetund puudutab tõendite järjekorda. Rakukatse tulemus ütleb, mida ühend saab teha ühe rakutüübiga kontrollitud kokkupuute korral. Luukatse tulemus ütleb, mida kuudepikkune süsteemne kokkupuude teeb elundiga, mis seob mehaanilise kontrolli all kahte rakutüüpi. Esimeses sünnivad hüpoteesid. Teises suri see hüpotees luustiku vananemise ja nende kahe antioksüdandi puhul.