Metüleensinine ja hulgiskleroos: mida loomuuringutes uuriti

Kui otsite teavet metüleensinise kasutamise kohta hulgiskleroosi korral, leiate artikleid, mis näivad vastavat samale küsimusele. Tegelikult see nii ei ole. Ühes uuringus anti haigetele hiirtele raviks metüleensinist. Teises ei ravitud sellega ühtegi looma. Metüleensinist kasutati sinise värvainena õhukestel seljaaju koelõikudel, et patoloog saaks mikroskoobi all müeliini näha.

See eristus on kogu artikli alus. Värvainel on bioloogias kaks rolli, mille ainus ühisosa on sama pudel. Ravimikandidaadina manustatakse seda elusloomale ja küsitakse, kas haiguse kulg muutub. Värvainena kantakse seda pärast katset surnud, fikseeritud koele ja küsitakse, milline kude välja nägi. Kui see erinevus jääb märkamata, võite lugeda patoloogiauuringu meetodite osa nii, nagu oleks see ravitulemus.

Mis on EAE lihtsas keeles?

Eksperimentaalne autoimmuunne entsefalomüeliit, tavaliselt lühendatult EAE, on standardne loomamudel hulgiskleroosi mõningate aspektide uurimiseks. Teadlane immuniseerib vastuvõtliku hiire müeliinivalgu fragmendi ja tugeva adjuvandiga. Seejärel ründab immuunsüsteem looma enda kesknärvisüsteemi. Hiirel tekib alt üles leviv nõrkus, mida on lihtne hinnata skaalal 0 kuni 5, lõtvunud sabast tagajäsemete halvatuseni.

Hindamise lihtsus selgitab nii EAE populaarsust kui ka seda, miks see võib eksitada. Inimese hulgiskleroos tekib iseeneslikult, hõlmab laiemat ja vähem täpselt määratletud sihtmärkide kogumit ning põhjustab nägemis-, tundlikkus-, kognitiivseid, väikeaju- ja motoorseid sümptomeid ägenemistega või progresseeruva haiguskulu korral. EAE jäljendab kontrollitud tingimustes valitud mehhanisme, näiteks põletikku, demüelinisatsiooni ja aksonikahjustust. See ei ole hulgiskleroosi miniatuurne koopia. Lugejad, kes soovivad üldist raamistikku, võivad enne ühegi konkreetse haigusega seotud väite hindamist tutvuda sellega, kuidas metüleensinine arvatavasti rakutasandil toimib.

Ka kaks allpool käsitletud uuringut kasutasid erinevaid EAE antigeene, mis on oluline. Raviuuringus kutsuti haigus esile MOG35-55-ga, müeliini oligodendrotsüütide glükoproteiinist pärineva lühikese peptiidiga. Patoloogiauuringus kutsuti haigus esile MP4-ga, mis on müeliini aluselise valgu ja proteolipiidvalgu segmentidest koosnev liitvalk. Hiireliini ja antigeeni valik mõjutab kahjustuskollete paiknemist ning põletiku kulgu, mistõttu ei ole need kaks uuringut ühe ja sama katse kaks kordust.

Ülevaade: mudelist küsimuse ja piiranguteni

Hoidke see tabel käepärast. See on artikli põhiline võrdlusalus. Iga rida näitab, millist kliinilist küsimust saab mudeliga uurida, mida tegelikult mõõdeti ja kus lõpeb tulemuste inimestele ülekandmise võimalus.

Järgmist pealkirja kontrollides saab igaüks samu veerge uuesti kasutada, võttes appi juhendi kuidas lugeda prekliinilisi uuringuid: küsige, millist liiki ja antigeeni kasutati, milline oli ühendi roll, milliseid tulemusnäitajaid mõõdeti ning kas tulemus kirjeldab haiguse kulgu või koe seisundit ühel ajahetkel.

Raviuuringu tulemus: mida manustamine muutis?

2016. aasta raviuuringus ajakirjas Journal of Neuroimmunology kasutati umbes 8 kuni 10 nädala vanuseid emaseid C57BL/6 hiiri, keda immuniseeriti 250 mikrogrammi MOG35-55-ga hiire kohta. Pärast haiguse esilekutsumist jaotati EAE-ga loomad juhuslikult metüleensinise rühma või ravimata EAE rühma ning kliinilisi skoore jälgiti ligikaudu 30. päevani.

Ravitud hiirte kliinilised skoorid olid 15. päevast 30. päevani oluliselt madalamad kui EAE kontrollrühmas, kusjuures P oli väiksem kui 0.01. Seljaaju analüüs näitas sama suunda: ravitud loomadel oli vähem põletikulist infiltratsiooni, vähem demüelinisatsiooni ja väiksem aksonikadu.

Uuringu eripära oli signaaliülekande näitajate kogum. Ravi suurendas AMPK aktivatsiooni ja SIRT1 ekspressiooni ning pärssis keskse põletikulise lüliti NF-kB aktivatsiooni. Adaptiivse immuunsuse poolel vähendas see Th17-vastust ja tugevdas Treg-vastust. Pakutud seoseahel on seega järgmine: metüleensinine mõjutab AMPK-d ja SIRT1-t, selle kaudu väheneb NF-kB signaaliülekanne, immuunvastus nihkub põletikuliselt Th17-vastuselt regulatoorse Treg-vastuse poole, koekahjustus on kergem ja kliinilised skoorid madalamad.

See ahel on tõlgendus, mitte tõestatud põhjuslik järjestus. Uuring näitab, et ravimi manustamine, signaaliülekande muutused ja haiguse leevenemine esinevad koos. See ei tõesta, et AMPK ja SIRT1 vahendavad kogu kasulikku mõju, ning avalikult indekseeritud tekst ei esita täpset annust milligrammides kilogrammi kohta, manustamisviisi, alustamispäeva ega kestust piisavalt selgelt, et raviskeemi saaks üksnes kokkuvõtte põhjal korrata. Käsitlege selle uuringu kohta müügilehel esitatud annusenumbreid kontrollimata teabena, kui need ei viita täisteksti meetodite osale. Metüleensinise kohta inimestel kogutud laiem tõendusmaterjal on koht, kust kontrollida, kas sellest esialgsest immuunsüsteemiga seotud leiust on kunagi jõutud kliiniliste andmeteni.

Patoloogiauuringu tulemus: mida näitas kude kuue kuu jooksul?

2015. aasta MP4-uuringus ajakirjas PLoS ONE kasutati emaseid C57BL/6 hiiri, keda immuniseeriti 200 mikrogrammi MP4-ga täielikus Freundi adjuvandis ning kellele anti lisaks läkaköhatoksiini immuniseerimispäeval ja uuesti 48 tundi hiljem. Ükski loom ei saanud metüleensinist ravimina. Pärast fikseerimist ja sisestamist valmistati ühe mikromeetri paksused seljaaju ristlõiked, mis värviti valgusmikroskoopia jaoks metüleensinisega; täpsemate üksikasjade uurimiseks kasutati ventrolateraalse juhtetee elektronmikroskoopiat.

Koeproove võeti kolmes etapis: ägeda faasi haripunktis 7 hiirelt, kolm kuud pärast haiguse algust 5 hiirelt ja kuus kuud pärast haiguse algust 10 hiirelt. Nende etappide keskmised kliinilised skoorid näisid peaaegu identsed, jäädes skaalal 0 kuni 5 ligikaudu vahemikku 1.7 kuni 1.8. Kude näitas teistsugust pilti. Ainult müeliinikahjustusega kiudude arv suurenes ägeda faasi haripunkti ligikaudu 569,000 kiult ruutmillimeetri kohta kuue kuu ajaks ligikaudu 1,496,000-ni; ägeda faasi ja pikaajalise tulemuse võrdlus oli statistiliselt oluline, P oli 0.027. Kombineeritud müeliini- ja aksonikahjustus ligikaudu kahekordistus kuue kuu jooksul. Remüeliniseeruvate kiudude osakaal jäi igas etapis alla ühe protsendi, mis on kainestav asjaolu taastumislootuste seisukohalt.

Aksonikahjustus järgis U-kujulist mustrit: see oli suur ägeda faasi haripunktis, väiksem kolme kuu järel ja kõige suurem kuue kuu järel ning korreleerus mitokondrite turse ja neurofilamentide vähenenud vahekaugusega. Hindajad ei teadnud kliinilist skoori ega haiguse etappi, mis tugevdab tõlgendust, et kliinilised skoorid ei kajastanud jätkuva struktuurse kahjustuse tegelikku ulatust.

See lahknevus on uuringu tegelik panus hulgiskleroosi kohta teavet otsivale lugejale. Stabiilne puude skoor ei tähendanud koe stabiilset seisundit. Samuti näitab see, miks see artikkel ei saa toetada ühtegi väidet metüleensinise kasutamise kohta hulgiskleroosi raviks. Uuriti aja mõju, mitte ravi.

Miks kumbki uuring ei tõesta kasu patsientidele?

Käsitlege kumbagi artiklit kui head vastust kitsale küsimusele, mis aga ei vasta üldse patsiente puudutavale küsimusele.

Esiteks on põhjus erinev. EAE kutsutakse sihilikult esile kindla antigeeni ja adjuvandiga. Inimese hulgiskleroos tekib spontaanselt ning hõlmab laiemat immuunsüsteemi komponentide kogumit, sealhulgas T-rakke, B-rakke, kaasasündinud immuunsust ja koes paiknevaid gliiarakke. Ühend, mis muudab hiirel MOG-le suunatud vastust, ei pruugi muuta inimese laiemat immuunvastust.

Teiseks on fenotüüp erinev. Hiirel sabast tagajäsemeteni leviv nõrkus on mugav mõõdetav näitaja. See taandab inimese hulgiskleroosi mitmekesisuse üheks motoorseks arvväärtuseks. Ravimid muudavad sageli EAE lühiajalisi skoore, muutmata inimestel haiguse kulgu. Seetõttu on EAE sõelumise ja mehhanismide uurimise vahend, mitte miniatuurne kliinik.

Kolmandaks on kokkupuude ravimiga ja ajastus lahendamata küsimused. Pidev varajane manustamine 30 päeva kestvas hiirekatses ei ole sama mis pikaajaline suukaudne kasutamine väljakujunenud haigusega inimesel ning kumbki uuring ei mõõtnud ravimi sisaldust närvisüsteemis. Ilma selle seoseta ei saa laboriplaadil kasutatud kontsentratsioonist või hiirele antud annusest tuletada inimese raviskeemi.

Neljandaks ei korda need kaks uuringut teineteist. Erinevad antigeenid, erinevad küsimused, erinevad tulemusnäitajad ning ühel juhul puudus ravi täielikult. Nende koos esitamine kahe positiivse hulgiskleroosi raviuuringuna on kategooriaviga.

Mida see tähendab tõendusmaterjali hindavale lugejale?

Need artiklid ei esita tõendatud metüleensinise raviprotokolli hulgiskleroosi jaoks. Raviuuring toetab AMPK, SIRT1, NF-kB ning Th17 ja Treg tasakaalu edasist uurimist MOG EAE korral. Patoloogiauuring tuletab meelde, et koekahjustus võib süveneda ka siis, kui skoorid näivad muutumatud, ning et metüleensinine meetodite osas tähendab mõnikord värvainepurki, mitte ravimikappi. Lugejad, kes jälgivad käimasolevaid hulgiskleroosiuuringuid, peaksid meeles pidama seda erinevust värvaine ja ravimi vahel. Ohutusküsimused, sealhulgas verega seotud riskid ja koostoimete riskid, tuleks koos metüleensinise üldiste ohutusandmetega arstiga läbi arutada, enne kui keegi laboriuuringute pealkirjade põhjal tegutsema hakkab.

Põhijäreldus mahub ühte lausesse. Ühes viidatud uuringus manustati MOG EAE-ga hiirtele metüleensinist ning täheldati kergemat haigust koos immuunvastuse nihkega põletikuvastases suunas, samas kui teises viidatud uuringus ei manustatud midagi ja metüleensinist kasutati ainult seljaaju värvimiseks, dokumenteerides kuue kuu jooksul kuhjuvat müeliini- ja aksonikahjustust, mistõttu ei tõesta need kaks uuringut, et metüleensinine aitab inimestel hulgiskleroosi korral.