Metüleensinine ja ferroptoos: raud, lipiidide peroksüdatsioon ja rakusurm

Ferroptoos on membraanikahjustusest tingitud rakusurm. Membraanide polüküllastumata rasvad oksüdeeruvad ahelreaktsioonis, membraan lakkab toimimast ja rakk sureb. Selleks keemiliseks protsessiks on vaja rauda. See lause võtab kokku kogu mõiste ning kõik selles artiklis käsitletu kontrollib selle mõnd osa.

Siinne küsimus on kitsam: mida teeb metüleensinine selle ahelaga rakukatsetes ja mida see tulemus tegelikult näitab? Lühike vastus on, et kahes laboriuuringus vähendas nanomolaarne metüleensinine mitokondrite lipiidide peroksüdatsiooni ja hoidis rakud elus pärast mõjutusi, mis muidu põhjustavad ferroptoosi. Pikem vastus on olulisem, sest ahela iga lüli kontrolliti erineva sekkumisega ning igal sekkumisel on piirangud.

Ferroptoos ühe lõiguga

Membraani fosfolipiidil, millel on polüküllastumata rasvhappe saba, on nõrk koht: vesinikuaatomid, mida on lihtne ära võtta. Kui radikaal ühe neist ära võtab, liitub lipiidiga hapnik, tekib lipiidne peroksüülradikaal ja see radikaal võtab vesiniku järgmiselt lipiidilt. Reaktsioon levib mööda membraani, kui miski seda ei peata.

Peamine pidurdaja on ensüüm nimega GPX4, mis kasutab glutatiooni lipiidperoksiidide redutseerimiseks kahjututeks lipiidalkoholideks. Laboratoorsed vallandajad ründavad seda kaitset kindlates kohtades. Erastiin blokeerib tsüstiini sisseveo süsteemi xc-miinus kaudu, jättes raku ilma glutatiooni sünteesiks vajalikust tsüsteiinist. Butioniinsulfoksimiin blokeerib glutatiooni sünteesi otse. RSL3 inhibeerib GPX4 ennast. Kõik kolm jätavad peroksiidid kõrvaldamata, kuid toimivad eri etappides, seega ei saa ühe vallandajaga saadud tulemust automaatselt teistele üldistada.

Ferroptoos erineb apoptoosist seda määratlevate omaduste poolest. Puuduvad kaspaasikaskaad ja apoptootilised kehakesed. Rauakelaatorid, näiteks deferoksamiin, ja radikaale püüdvad ained, näiteks ferrostatin-1, pärsivad seda. See on praktiline katse, mille põhjal teadlased nimetavad rakusurma ferroptootiliseks, mitte lihtsalt nekrootiliseks. Reguleeritud rakusurma radade laiem käsitlus asetab selle eristuse konteksti ning rakkude labiilse raua käitlemine selgitab, miks kelaatumine on nii otsustav kontrollvõte.

Milline on mitokondrite roll ja miks selle üle vaieldi

Varasemates töödes teatati, et ka mitokondriaalse DNA-ta rakud läbivad ferroptoosi, mis viitas sellele, et mitokondrid ei ole hädavajalikud. Hilisemates töödes leiti, et mitokondrite hulga vähendamine või rakuhingamise blokeerimine võib pärssida tsüsteiinipuudusest põhjustatud ferroptoosi, kuid mitte GPX4 otsesest inhibeerimisest tingitud ferroptoosi. Mõlemad tulemused võivad olla õiged, kui mitokondrite panus sõltub vallandajast, rakutüübist ja sellest, kus toimub määrava tähtsusega peroksüdatsioon.

Selle artikli aluseks olev uuring käsitles vaidlust kindlale rakukompartmendile suunatud sondiga. MitoCLox on mitokondritele suunatud lipiidide peroksüdatsiooni indikaator: selle fluorestsents muutub kokkupuutel lipiidsete peroksüülradikaalidega mitokondrites. Erastiiniga töödeldud fibroblastides ilmnes mitokondriaalse sondi oksüdeerumine veel elusates rakkudes enne rakusurma ning see oli rakupopulatsioonis ebaühtlane. See ajaline järjestus on oluline. Surmale eelnev peroksüdatsioon võib olla selle põhjus. Ainult surnud rakkudes mõõdetud peroksüdatsioon on lagunemise jälg. Täiendav juhend lipiidide peroksüdatsiooni analüüside ja iga sondi näidatava kohta selgitab, miks sondi asukoht määrab signaali tähenduse.

Sama muster ilmnes teises mudelis. Leberi päriliku optilise neuropaatiaga patsiendi fibroblastid, millel on kompleksi I mutatsioon ja suurem oksüdatiivne stress juba algtasemel, surid glutatiooni ammendumisel ferroptoosi tõttu, samal ajal kui kontrollfibroblastid pidasid vastu. Mitokondriaalse sondi oksüdeerumine toimus taas esimesena. Üksikasjad on esitatud fibroblastiuuringus mitokondrite lipiidide peroksüdatsiooni kohta ferroptoosis.

Mida metüleensinine nendes katsetes muutis

Metüleensinine on redokskandja. Selle oksüdeeritud vorm võtab kompleksis I elektrone vastu NADH-ga seotud reaktsioonidest ning redutseeritud vorm loovutab need tsütokroom c-le, mis varustab elektronidega kompleksi IV. Nii tekib osaline möödaviik ahela lõigust, kus elektronid tavaliselt hapnikule lekivad ja superoksiidi moodustavad. Lugejad, kes soovivad täielikku ülevaadet elektronide edasikandumisest, võiksid alustada artiklist kuidas metüleensinine elektrone läbi mitokondrite liigutab.

Erastiiniga töödeldud kopsufibroblastides säilitas metüleensinine kontsentratsioonil 250 nanomolaari rakkude eluvõimelisuse, mida hinnati ellujäämisanalüüsiga, nagu ka mitokondritele suunatud antioksüdandid SkQ1 ja MitoTEMPO. Kontrollid määravad väite ulatuse. Ka ferrostatin-1, alfa-tokoferool ja deferoksamiin pakkusid kaitset, mis kinnitab, et rakusurm oli ferroptootiline. Antioksüdantse rühmata SkQ1 analoog kaitset ei pakkunud, mis osutab redoksreaktsioonidele, mitte mittespetsiifilisele kuhjumisele. Kaitse nõrgenes SkQ1 kontsentratsioonidel üle ligikaudu 200 nanomolaari, mis on kooskõlas kinoonantioksüdantide teadaoleva prooksüdantse käitumisega suurema koormuse korral. Metüleensinisel on samasugune kahetine annusest sõltuv toime: nendes katseanumates kaitses see madalatel nanomolaarsetel kontsentratsioonidel, kuid suurematel kontsentratsioonidel või tugeva valgustuse korral võib see redokstsüklite kaudu tekitada vesinikperoksiidi. Sellist annusest sõltuvat konteksti käsitleb artikkel reaktiivsetest hapnikuliikidest mitokondrites.

Seejärel eristati isoleeritud mitokondritega tehtud katsetes ROS-i allikad. Kahevalentse raua juuresolekul stimuleerisid kompleksi I elektronidega varustavad substraadid koos rotenooniga sondi oksüdeerumist. Rotenoon blokeerib elektronide liikumise flaviini seondumiskohast allavoolu, mistõttu eelnevad kandjad jäävad redutseerituks ning maatriksi poole suunatud flaviinilt lekivad elektronid hapnikule. Kompleksi III elektronidega varustavad substraadid koos antimütsiin A-ga tekitasid rohkesti vesinikperoksiidi, kuid ei käivitanud lipiidide peroksüdatsiooni. Sama üldine ROS-signaal, erinev asukoht, erinev tulemus. Nii SkQ1 kui ka metüleensinine pärssisid kompleksist I lähtuvat peroksüdatsiooni, pärssimata vesinikperoksiidi teket ennast. See paigutab nende toime ROS-i tekke järgsesse lipiidide peroksüdatsiooni etappi.

Raua ülekoormuse uurimissuund ja lipofustsiini vihje

Teine uuring lähenes küsimusele raua poolt. H9c2 kardiomüotsüütides, mida mõjutati ferriammooniumtsitraadiga kontsentratsioonil alla millimolaarse taseme, tekkis mitokondriaalne ROS, mitokondrite lipiidide peroksüdatsioon ja seejärel ferroptoos, millele järgnes lipofustsiinilaadse pigmendi kuhjumine 24 tunni jooksul. Lipofustsiin on oksüdeeritud lipiidide ja valkude autofluorestseeruv, rauda sisaldav jääk, mis koguneb vanusega. Selle kiire ilmumine siin seob ägeda rauast lähtuva peroksüdatsiooni klassikalise vananemismarkeriga. Nii nanomolaarne metüleensinine kui ka SkQ1 hoidsid ära peroksüdatsiooni, rakusurma ja pigmendi kuhjumise. Isoleeritud südamemitokondrid kinnitasid sama mustrit: rotenoon koos kahevalentse rauaga käivitas peroksüdatsiooni ja pigmendilaadse signaali tekke ning mõlemad ained blokeerisid selle. Kogu sündmuste jada on kirjeldatud raua ülekoormuse uuringus H9c2 kardiomüotsüütidega. Pigmendiga seotud osa täiendab käsitlus lipofustsiinist ja rakkude vananemismarkeritest.

Mida rakkude ellujäämisanalüüsid ei näita

Eluvõimelisuse analüüs, näiteks CellTiterBlue, näitab, kui palju rakke katseanumas jääb metaboolselt aktiivseks pärast vallandaja ja võimaliku kaitsva aine lisamist. See kontrollib mehhanismi kindlaksmääratud süsteemis. See ei ole ravitulemus. Üheski neist katsetest ei manustatud ainet patsiendile, ei mõõdetud haigusega seotud tulemusnäitajat ega määratud organismis terapeutilist vahemikku.

Neli piirangut väärivad selget väljatoomist. Esiteks on rakutüüpide valik kitsas: transformeerunud kopsufibroblastid, primaarsed nahafibroblastid, sealhulgas üks mitokondriaalse haigusega rakuliin, ning roti kardiomüotsüütide liin ja isoleeritud roti südamemitokondrid. Tundlikkus erines liiniti ning LHON-liin oli uuringu ülesehituse tõttu ebatavaliselt haavatav. Teiseks on vallandajad laboratoorsed äärmused: transpordi või sünteesi täielik blokeerimine ning rauakoormused, millega ükski kude ägedalt kokku ei puutuks. Kolmandaks ei saa kontsentratsiooni pelga korrutamisega üle kanda. Nanomolaarne kontsentratsioon kultuurisöötmes ei ole inimese annus ning katseanuma ja inimese vahele jäävad metüleensiniise jaotumine, redutseerumine värvituks vormiks veres ja kudedes, kokkupuude valgusega ning membraanipotentsiaal. Neljandaks annavad sondid teavet oma kompartmendi kohta. MitoCLoxi oksüdeerumine näitab, et mitokondrites tekkisid lipiidradikaalid; see ei näita, et plasmamembraani rebenemist, mis on tõenäoliselt lõplik sündmus, takistati otseselt, mitte ei välditud varasema etapi kaudu.

Seega on aus väide järgmine: nendes mudelites põhjustavad kompleksist I lähtuv ROS ja raud mitokondrite lipiidide peroksüdatsiooni, mis eelneb ferroptoosile, ning metüleensinine katkestab madalatel kontsentratsioonidel selle lõigu. Kõik sellest lõigust kaugemale ulatuv vajab teistsuguseid katseid loomadel ja seejärel inimestel.