Metüleensinine ajukahjustuse korral: prekliiniliste tõendite mõistmine

Löök pähe, ummistunud arter ja aeglaselt kulgev neurodegeneratiivne haigus võivad kõik lõppeda sama probleemiga: ajul ei ole enam oma töö tegemiseks piisavalt energiat. See ühine lõpptulemus selgitab, miks üks ja sama ühend ilmub pidevalt kõigi kolme valdkonna teaduskirjanduses. Kuid ühine lõpptulemus ei tähenda ühist käsitlust. Enne vigastust manustatud ravi, sellele järgneva tunni jooksul manustatud ravi ja ravi, mille tulemusi hinnatakse kuid hiljem, katsetavad erinevaid ideid, isegi kui süstlas on sama sinine vedelik.

See artikkel käsitleb selle teaduskirjanduse ajukahjustusele keskenduvat osa. See annab ülevaate sellest, mida tähendab metüleensinise kasutamine ajukahjustuse korral loomkatsetes, eristab traumaatilist kahjustust insuldist ja kroonilisest neurodegeneratsioonist ning näitab, miks annuse manustamise ajastus selgitab enamikku uuringutevahelistest erinevustest.

Kolm kahjustust, üks energiatootmise häire

Neid mudeleid ühendav mehhanism asub mitokondrites. Tavaliselt liiguvad elektronid mööda elektrontranspordiahelat, et toota ATP-d, ning tervena toimiv ahel hoiab reaktiivsed hapnikuühendid kontrolli all. Pärast kahjustust hakkavad ahela osad tõrkuma, ATP tootmine väheneb ja vabade radikaalide teke suureneb. Ajakirja Molecular Neurobiology 2018. aasta ülevaade kirjeldab metüleensinist alternatiivse elektronide kandjana: see võtab elektrone vastu NADH-lt ja annab need edasi tsütokroom c-le, mis suurendab kompleksi IV aktiivsust ning taastab ATP sünteesi isegi siis, kui ahela algusosa on kahjustatud.

Esitatud arvud on konkreetsed. Raku- ja koelõigupreparaatides suurenes kompleksi IV aktiivsus 30 kuni 100 protsenti ning hapnikutarbimine kasvas samas tempos, mis näitab, et lisaelektronid tegid kasulikku tööd, mitte ei lekkinud radikaalidena. Rottide insuldimudelis oli ATP tootmine kahjustatud piirkonnas 24 tundi pärast ravi umbes 30 protsenti suurem kui ravimata loomadel. Ajakirja Biochemistry (Moscow) 2022. aasta ülevaade lisab sellele järgnevad tagajärjed: vähem oksüdatiivset stressi, vähem närvikoe põletikku, vähem apoptoosi ning mõju monoamiini oksüdaasile, lämmastikoksiidi süntaasile, mitokondrite biogeneesile, autofagiale ja valesti voltunud valkude agregatsioonile.

Seega on idee lihtne. Kahjustus takistab elektronide tavapärast liikumisteed ning metüleensinine pakub ümbersõitu. Kõik järgnev sõltub sellest, millise kahjustusega on tegemist, millal ainet manustatakse ja kuidas tulemusi mõõdetakse.

Ajutrauma ei ole insult

Ajutrauma mudelis mõjub jõud korraga. Esmane kahjustus on mehaaniline: kude rebeneb, veresooned lõhkevad ja hematoentsefaalbarjäär muutub minutitega läbilaskvaks. Metüleensinine võib tõenäoliselt mõjutada järgnevat sekundaarset kahjustuslainet, mis areneb tundide ja päevade jooksul, kui ellujäänud koe mitokondrite töö häirub, põletik levib ja turse suureneb. Nende uuringute tulemusnäitajad peegeldavad seda järjestust: kahjustuskolde maht, aju veesisaldus, neuronite ellujäämine löögipiirkonna lähedal ja hilisem käitumine, näiteks motoorne taastumine või õppimine labürindis.

Insuldi või globaalse isheemia mudelis on kahjustuse tekkekäik teistsugune. Verevool peatub, mõne minuti jooksul tekib energiapuudus ning verevoolu taastumine põhjustab omakorda reperfusioonikahjustust. Siin ajastatakse manustamine veresoontega seotud sündmuse järgi, sageli mõne minuti jooksul pärast sulgust või reperfusiooni, ning tulemusnäitajad mõõdavad koe akuutset saatust tundide kuni ühe-kahe päeva jooksul: infarkti suurust, verevoolu ja varajast funktsionaalset taastumist. Üks insuldikirjanduses esinev lähenemine on eelmanustamine: loomadele antakse ainet enne veresoone sulgemist. See katsetab ennetust viisil, mida ükski peatrauma katse ei saa inimestel eetiliselt jäljendada.

Insuldiuuringute tulemused on ajukahjustuse kirjanduses kõige tugevamad ning nende seas on ka kõige selgem tulemus, kus mõju puudus. Rottidel, kellele anti metüleensinist reperfusiooni ajal pärast keskmise ajuarteri ühe tunni pikkust sulgust, olid infarktid 2. päeval 30 protsenti väiksemad ning rohkem ohustatud tuumala ja penumbra kude säilis (Shen, 2013). Püsiva sulguse uuringus arenes ohustatud kude infarktiks aeglasemalt, kuid kumbki katsetatud annus ei vähendanud lõplikku infarkti mahtu 24 tunni möödudes (Rodriguez, 2014). Kolmandas sulguse uuringus vähenes infarkti suurus keskmise annuse korral ligikaudu poole võrra ning mitokondrite ultrastruktuuri ja mitofaagiat dokumenteeriti otse isheemilises ajus. Samas teatati ootamatust üksikasjast: mõõdetud apoptoos suurenes, samal ajal kui nekroos vähenes (Di, 2015). Globaalse isheemia korral taastas pidev väikese annusega infusioon tsütokroom c oksüdaasi aktiivsuse, ATP taseme ja mitokondrite membraanipotentsiaali hipokampuse haavatavas CA1 piirkonnas, säilitas sealsed neuronid ning kaitses ruumilist mälu (Lu, 2016). Selle CA1 mõõtmise juures tasub peatuda: tegemist on otseste ATP ja hingamisahela andmetega kahjustatud ajust, samas kui ajutrauma kirjanduses neid enamasti järeldatakse, mitte ei mõõdeta.

Krooniline neurodegeneratsioon erineb mõlemast. Alzheimeri, Parkinsoni ja Huntingtoni tõve mudelites manustatakse loomadele ainet nädalate või kuude jooksul ning mõõdetakse valkude agregatsiooni, dopamiini käitlemist või kognitiivsete võimete järkjärgulist halvenemist. Neil tulemusnäitajatel pole peaaegu midagi ühist kahjustuskoldega, mida mõõdetakse mõni päev pärast lööki. Lugejad, kes kannavad ühe valdkonna tulemuse üle teise, viivad leiu üle piiri, mida katsed ise ei ületanud. Meie neurodegeneratsiooni käsitleva teaduskirjanduse juhend hoiab need pika ajaskaalaga uuringud omaette raamistikus ning võrdlus ainult insulti käsitlevate tõenditega eristab üksikasjalikult veresoonte sulgusel põhinevaid katseid lööktrauma katsetest.

Mida ajutrauma mudelites tegelikult tehti

Ühtegi metüleensinise ajutrauma uuringut inimestel ei ole avaldatud. Kõik ajutrauma andmed pärinevad loomkatsetest, peamiselt rottide ja hiirtega, ning koonduvad väikese hulga katsete ümber, mida tasub eraldi nimetada, sest nende üksikasjad erinevad viisil, mille kokkuvõtted sageli kustutavad.

Varaseimas kontrollitud ajukoore lööktrauma uuringus anti rottidele intravenoosselt 1 mg/kg üks tund pärast kerget lööki ning seejärel 0.5 mg/kg kolme tunni möödudes (Watts, 2014). MRT-ga mõõdetud kahjustuskolde maht püsis ravitud loomadel väiksem kogu kahenädalase jälgimisperioodi jooksul. Kõndimistestis vähenes valesammude arv oluliselt 1., 2. ja 7. päeval, kuid mitte 14. päeval. Mikroskoopilisel hindamisel 14. päeval oli kahjustatud ajukoores degenereeruvate neuronite arv vaatevälja kohta 270 võrreldes 368-ga ning ebanormaalse Nissli värvingu näitaja 41 võrreldes 73-ga. Teisisõnu esines varajane kaitse, kuid käitumuslik eelis oli teiseks nädalaks hääbumas.

Difuusse kahjustuse katses kasutati hiirtel keskjoone vedelikulööki ning poole tunni jooksul manustati üks intravenoosne annus 2 mg/kg (Fenn, 2015). Ravitud loomadel oli põletikuga seotud geenide avaldumine tagasihoidlikum, põletikulisi mikrogliiarakke vähem, nähtavat turset vähem ning 7. päeval ei ilmnenud depressioonilaadset käitumist. Sama tähtsad on mõju puudumist näidanud tulemused: vigastus ise suurendas aju veesisaldust vaid mõõdukalt ning metüleensinine ei leevendanud kehakaalu langust ega motoorse koordinatsiooni puudujääki. Põletikuvastane toime ei ole sama mis täielik kaitse.

Kahes hiireuuringus kasutati sama manustamisskeemi: 1 mg/kg ühe tunni möödudes, 0.5 mg/kg kuue tunni möödudes ning seejärel igapäevane manustamine kolme päeva jooksul. Need uuringud avardasid arusaama mehhanismist. Ajukoore lööktrauma mudelis vähendas ravi kahjustuskolde mahtu 24 tunni ja 72 tunni möödudes ning 14. päeval, säilitades samal ajal neuroneid ja suurendades autofagia markerite taset (Zhao, 2016). Vedelikulöögimudelis vähendas see neuronite apoptoosi, vähendas lekkiva hematoentsefaalbarjääri läbilaskvust ning parandas neuroloogilisi skoore kahe nädala jooksul (Shen, 2019). Zhao uuringus ei olnud aga 72 tunni möödudes aju veesisalduses erinevust ning Sheni uuringus puudus erinevus pöörleva varda testi soorituses 1. ja 3. päeval. Kahjustuskolde ja rakkude ellujäämise näitajad muutusid, kuid turse ja varajase motoorika näitajad ei paranenud alati koos nendega.

Ajastuse poolest paistab silma hilisema manustamise katse (Watts, 2016). Sama lööktrauma mudelit kasutades lükati esimene annus edasi kuni 24 tunni möödumiseni vigastusest. 2. päevaks oli hiljem ravitud rühmas kahjustuskolde vähenemine võrreldav esimestel tundidel ravitud loomadega ning vähenemine püsis ka 7. ja 14. päeval. Käitumuslik mõju oli nõrgem: valesammude vähenemine hiljem ravitud rühmas oli statistiliselt mitteoluline suundumus. Üks labor, üks mudel, üks 24 tunni pikkune ajaaken. See on tõeline tõend, et ajaaken ulatub esimestest tundidest kaugemale, kuid see on ka kogu tõendusmaterjal selle väite kohta. Tasub märgata lõksu sõnas „hiline” mujal: üks Venemaa uuringusari, mille pealkiri keskendus hilisele neuroprotektsioonile, manustas ainet 30 minuti möödudes ning kasutas sõna „hiline” pikaajaliste tulemuste, mitte hilise ravi alustamise tähenduses.

Väiksem rottide fokaalse kahjustuse uuring täiendab ajastuse pilti teisest suunast: nii vahetult enne vigastust kui ka 30 minutit pärast seda manustatud aine vähendas jäsemete funktsioonihäiret (Stelmashook, 2019). Eelmanustamine toimib laboris just seetõttu, et labor määrab vigastuse aja.

Annuste täpne arvestamine on siin oluline. Ülevaated kirjeldavad väikeseid annuseid mitokondriaalset hingamist stimuleerivana ja suuri annuseid pärssivana; sama kahefaasiline muster esineb metüleensinise farmakoloogias laiemalt. Seetõttu ei saa tulemusi tõlgendada põhimõttel „rohkem sinist, parem taastumine”. Iga uuring katsetab üht punkti kõveral. Annuse-toime seose selgitus jälgib seda kõverat eri mudelites ning ohutuse ja kõrvaltoimete ülevaade käsitleb seda, mida suuremad annused selle asemel teevad.

Vaadake seda tabelit ridade kaupa: sama ühend, kolm erinevat ajaskaalat. Ennetus kuulub keskmisse ritta, kohene ravi kahte esimesse ning hilisemad tulemused esimesse ja kolmandasse.

Ennetus, kohene ravi, hilisemad tulemused

Ennetus on väide, mida on kõige lihtsam valesti mõista. Isheemia mudelites läheb enne veresoone sulgemist ainet saanud loomadel paremini ning mõnikord tsiteeritakse seda tulemust nii, nagu kaitseks metüleensinine iga aju mis tahes tulevase kahjustuse eest. Seda see ei näita. See näitab, et alternatiivse elektronide liikumisteega ette valmistatud mitokondrid taluvad plaanipärast verevoolu katkemist paremini. Keegi ei planeeri peavigastust.

Ajutrauma tõendid keskenduvad kohesele ravile. Manustamine löögile järgnevate tundide jooksul on suunatud alles arenevale sekundaarse kahjustuse kaskaadile: energiapuudusele, oksüdatiivsele stressile, põletikule ja tursele. Siin paranevad kahjustuskolde ja turse näitajad on tõelised ravitoimed, kuid need tähendavad protsessi ravimist, mitte rebenenud koe taastamist.

Hilisemad tulemused on kolmas mõiste. Nädalaid pärast vigastust mõõdetud käitumine või kuid kestnud degeneratiivses mudelis mõõdetud valkude käitlemine vastab küsimusele, kas varajane kaitse püsis või kas aeglased protsessid muutsid kulgu. Väiksem kahjustuskolle 24 tunni möödudes, statistiliselt mitteoluline käitumuslik suundumus pärast 24 tunni võrra edasi lükatud annust ning parem labürindisooritus kuid kestnud kroonilise manustamise järel on kolm erinevat väidet, mille tõendamise nõuded on erinevad. Praegu on üksnes esimene neist oma tõenduskünnise ületanud rohkem kui korra.

Mida need tõendid näidata ei saa

Kõigil eespool kirjeldatud tulemustel on sama piir. Näriliste mitokondrid reageerivad metüleensinisele viisil, mis võib olla ühine inimese mitokondritega, kuid rott, kellele manustatakse intravenoosne annus mõni minut pärast täpselt kontrollitud lööki, ei ole sama mis inimene, kes saabub erakorralise meditsiini osakonda mitu tundi pärast kukkumist. Anesteesia, kontrollitud vigastusraskus, noored terved loomad ja lühike jälgimisaeg piiravad kõik tulemuste ülekantavust. Metüleensinise kohta ei ole üldse ühtegi plahvatusest põhjustatud vigastuse uuringut, nii et sõjaväelastest lugejatele kõige asjakohasema vigastustüübi kohta on kõige vähem tõendeid.

Samuti ei anna need uuringud alust annuste ülekandmiseks inimesele. Loomuuringutes kasutatakse intravenoosset ja intraperitoneaalset manustamist annustes, mis on valitud katse kontrollitavuse tagamiseks, mitte jaemüügis pakutavaid suukaudseid tilku. Miski neis uuringutes ei määra inimese raviskeemi ning siin ei katsetata metüleensinist koos tavapärase peavigastuse raviga.

Seega mahub aus kokkuvõte ühte lõiku. Närilistel säilitab traumaatilise või isheemilise ajukahjustuse tekkimise ajal või selle lähedal manustatud metüleensinine mitokondrite energiatootmist ning sellele järgnevad väiksemad kahjustuskolded ja paremad taastumisskoorid. Ühes lööktrauma uuringus säilis osa kahjustuskollet vähendavast mõjust ka siis, kui esimene annus lükati 24 tunni võrra edasi. Kas midagi sellist toimub ka kahjustatud inimajus, on katsetamata, ning ajutrauma- ja insuldikirjanduses uuritakse erinevaid ajastusi erinevate tulemusnäitajate suhtes. Igaüks, kes müüb nende tõendite põhjal kindlust, lisab koostisosa, mida katsetes kunagi ei olnud.