Μέτρηση δραστικών μορφών οξυγόνου σε πειράματα με κυανό του μεθυλενίου

Δύο εργαστήρια διεξάγουν αυτό που το καθένα αποκαλεί πείραμα αντιοξειδωτικής δράσης του κυανού του μεθυλενίου. Το ένα αναφέρει ότι η χρωστική καταστέλλει τις δραστικές μορφές οξυγόνου. Το άλλο αναφέρει ότι τις παράγει. Και τα δύο παρουσιάζουν σαφείς καμπύλες δόσης–απόκρισης. Και τα δύο είναι ειλικρινή. Η διαφορά δεν οφείλεται σε απάτη ή ανεπάρκεια. Οφείλεται στο ότι οι δύο ομάδες μέτρησαν διαφορετικά πράγματα υπό διαφορετικό φωτισμό, με ανιχνευτές που απαντούν σε διαφορετικά ερωτήματα, και έπειτα περιέγραψαν και τις δύο απαντήσεις με την ίδια λέξη: ROS.

Το κυανό του μεθυλενίου είναι ένα μόριο που δύσκολα μετριέται με ακρίβεια, επειδή συμμετέχει στη χημεία που υποτίθεται ότι παρατηρεί. Στο σκοτάδι μεταφέρει ηλεκτρόνια μεταξύ δοτών και δεκτών και επιστρέφει στην αρχική του μορφή, έτοιμο να επαναλάβει τον κύκλο. Υπό φωτισμό γίνεται φωτοευαισθητοποιητής, φτάνοντας σε διεγερμένη τριπλή κατάσταση από την οποία μπορεί να μεταφέρει ενέργεια στο οξυγόνο για να σχηματίσει μονήρες οξυγόνο ή να μεταφέρει ηλεκτρόνια για να σχηματίσει ρίζες και υπεροξείδιο του υδρογόνου. Κάθε ανιχνευτής που τοποθετείται σε αυτό το σύστημα μπορεί να οξειδωθεί, να αναχθεί, να αποχρωματιστεί ή να καλυφθεί οπτικά από την ίδια τη χρωστική. Επομένως, το πρώτο ερώτημα για οποιαδήποτε μέτρηση ROS δεν είναι ποτέ ποια είναι η αριθμητική τιμή. Είναι τι ανιχνεύει πραγματικά η δοκιμασία και πώς επηρεάζει η χρωστική τη δοκιμασία.

Amplex Red: μια βαθμονομημένη δοκιμασία υπεροξειδίου του υδρογόνου

Ο συνδυασμός κυανού του μεθυλενίου και Amplex Red είναι ο πιο τεκμηριωμένος συνδυασμός σε αυτή τη βιβλιογραφία, όταν εφαρμόζεται σωστά. Η χημεία είναι ειδική: η υπεροξειδάση χρένου χρησιμοποιεί υπεροξείδιο του υδρογόνου για να οξειδώσει το υπόστρωμα Amplex σε ένα φθορίζον προϊόν, τη ρεσορουφίνη, με στοιχειομετρία περίπου ένα προς ένα. Το υπεροξείδιο του δείγματος μετατρέπεται σε φθορισμό στον ανιχνευτή. Καμία άλλη μορφή από την κλασική οικογένεια ROS δεν προκαλεί άμεσα αυτή την αντίδραση.

Το καθοριστικό πλεονέκτημα είναι η βαθμονόμηση. Ένας προσεκτικός ερευνητής μετρά πρότυπα γνωστής συγκέντρωσης υπεροξειδίου στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα, με τις ίδιες συγκεντρώσεις υπεροξειδάσης και υποστρώματος, τον ίδιο χρόνο επώασης και τις ίδιες οπτικές ρυθμίσεις, και στη συνέχεια αξιολογεί τα δείγματα βάσει αυτής της καμπύλης. Στη μελέτη με απομονωμένα μιτοχόνδρια εγκεφάλου στην οποία βασίζεται αυτή η μέθοδος, οι συγγραφείς έκαναν ακριβώς αυτό, προσθέτοντας γνωστές ποσότητες υπεροξειδίου στο τέλος κάθε πειραματικής εκτέλεσης. Οι τιμές αναφέρονται ως ρυθμοί σε πικομόλ ανά λεπτό ανά χιλιοστόγραμμο πρωτεΐνης και όχι ως αυθαίρετες μονάδες φθορισμού. Αυτό είναι που μετατρέπει μια λάμψη σε μέτρηση.

Τρεις λεπτομέρειες αυτής της μελέτης αξίζει να υιοθετηθούν. Πρώτον, οι συγγραφείς επαλήθευσαν το σήμα με καταλάση, η οποία διασπά το υπεροξείδιο. Η αύξηση του φθορισμού που προκαλούσε το κυανό του μεθυλενίου σταμάτησε όταν προστέθηκε καταλάση, επιβεβαιώνοντας ότι το σήμα προερχόταν από υπεροξείδιο και όχι από οπτικό τεχνούργημα. Δεύτερον, εξέτασαν άμεσα τον φωτισμό, χρησιμοποιώντας κλείστρο στη δέσμη διέγερσης ώστε τα δείγματα να δέχονται το ένα όγδοο της συνήθους δόσης φωτός, και το σήμα μειώθηκε μόνο κατά εννέα τοις εκατό. Περισσότερο από το ενενήντα τοις εκατό του υπεροξειδίου που ανέφεραν ήταν ανεξάρτητο από το φως της μέτρησης. Τρίτον, μέτρησαν ξεχωριστά την απομάκρυνση του υπεροξειδίου με ηλεκτρόδιο και διαπίστωσαν ότι η χρωστική αύξανε την παραγωγή και ταυτόχρονα επιβράδυνε την απομάκρυνσή του. Ένας ανιχνευτής που αναφέρει μόνο τον καθαρό φθορισμό θα είχε συγχωνεύσει αυτές τις δύο επιδράσεις.

Η δοκιμασία εξακολουθεί να έχει τρόπους αστοχίας, και το κυανό του μεθυλενίου αναδεικνύει αρκετούς από αυτούς. Η χρωστική απορροφά σε ευρύ φάσμα στην ίδια ερυθρή περιοχή όπου εκπέμπει η ρεσορουφίνη, οπότε σε υψηλές συγκεντρώσεις χρωστικής το δείγμα μπορεί να καλύψει το ίδιο του το σήμα μέσω φαινομένων εσωτερικού φίλτρου. Τα πρότυπα θα πρέπει επομένως να περιέχουν την ίδια συγκέντρωση χρωστικής με τα δείγματα. Το Amplex Red μπορεί επίσης να φωτοοξειδωθεί από μόνο του, ενώ το προϊόν του, η ρεσορουφίνη, μπορεί να συμμετάσχει σε φωτοοξειδοαναγωγικούς κύκλους που παράγουν υπεροξείδιο του ανιόντος οξυγόνου και υπεροξείδιο του υδρογόνου. Αυτό έχει ιδιαίτερη σημασία όταν το πείραμα φωτίζει παράλληλα έναν φωτοευαισθητοποιητή. Η πρακτική λύση είναι να ακτινοβολούνται πρώτα τα δείγματα κυανού του μεθυλενίου και να εξετάζονται κατόπιν κλάσματά τους με αντιδραστήρια Amplex στο σκοτάδι, αντί να φωτίζονται μαζί η χρωστική και ο ανιχνευτής. Τέλος, η δισμουτάση του υπεροξειδίου δεν καταστέλλει απλώς ένα σήμα Amplex: η μετατροπή του υπεροξειδίου του ανιόντος οξυγόνου σε υπεροξείδιο του υδρογόνου μπορεί να το αυξήσει. Ένας έλεγχος με SOD που αυξάνει τον φθορισμό δεν έχει αποτύχει. Έχει εντοπίσει το υπεροξείδιο του ανιόντος οξυγόνου ως μορφή που προηγείται στην αλληλουχία αντιδράσεων.

DCFDA: ένας μη ειδικός δείκτης οξείδωσης

Ο συνδυασμός κυανού του μεθυλενίου και DCFDA είναι η πηγή του μεγαλύτερου μέρους της σύγχυσης. Το DCFH-DA είναι μια πρόδρομη ένωση για τη φόρτωση των κυττάρων με τον ανιχνευτή. Οι εστεράσες μέσα στο κύτταρο αφαιρούν τις οξικές ομάδες του, αφήνοντας μη φθορίζον DCFH, και η οξείδωση του DCFH αποδίδει φθορίζον DCF. Ο κατάλογος των παραγόντων που το οξειδώνουν είναι μακρύς: ρίζες υδροξυλίου, ενδιάμεσα υπεροξειδάσης και αίμης, διοξείδιο του αζώτου, υποχλωριώδες οξύ και ρίζες που προέρχονται από υπεροξυνιτρώδες. Το υπεροξείδιο του υδρογόνου από μόνο του δεν το οξειδώνει άμεσα με πρακτικά αξιοποιήσιμο ρυθμό· ο φθορισμός που εξαρτάται από υπεροξείδιο απαιτεί γενικά τη συμμετοχή σιδήρου, πρωτεϊνών αίμης ή χημείας υπεροξειδάσης.

Η κριτική ανάλυση που θα έπρεπε να παραπέμπει κάθε ενότητα μεθόδων προέρχεται από την εξέταση του DCFH ως ανιχνευτή από τον Kalyanaraman και τους συνεργάτες του, όπως συνοψίζεται στη μελέτη μιτοχονδρίων εγκεφάλου που απέρριψε το DCFDA για αυτόν τον λόγο. Η ανάλυση έδειξε ότι η χρωστική αντιδρά αργά, με μη χαρακτηρισμένη στοιχειομετρία, χωρίς έγκυρη βαθμονόμηση και με ενώσεις που δεν είναι ROS. Ο ανιχνευτής ενισχύει επίσης αυτό που μετρά: η οξείδωση του DCFH κατά ένα ηλεκτρόνιο παράγει μια ρίζα DCF που αντιδρά με το οξυγόνο σχηματίζοντας υπεροξείδιο του ανιόντος οξυγόνου, το οποίο δυσμουτάται σε επιπλέον υπεροξείδιο του υδρογόνου. Η μέτρηση δημιουργεί εν μέρει τη χημεία που αναφέρει.

Τίποτε από αυτά δεν καθιστά το DCFDA άχρηστο. Το καθιστά εργαλείο προκαταρκτικού ελέγχου, όχι ταυτοποίησης. Μια αύξηση του φθορισμού DCF σημαίνει ότι αυξήθηκε η οξείδωση του ανιχνευτή που εξαρτάται από οξειδωτικούς παράγοντες. Δεν σημαίνει ότι αυξήθηκε το υπεροξείδιο του υδρογόνου, και ασφαλώς δεν σημαίνει ότι αυξήθηκαν οι συνολικές ROS, μια ποσότητα που κανένας μεμονωμένος ανιχνευτής δεν μετρά. Παλαιότερες εργασίες με κυανό του μεθυλενίου που βασίστηκαν στην οξείδωση DCF σε συγκεντρώσεις πάνω από ένα μικρομοριακό ανέφεραν προοξειδωτικές επιδράσεις, ενώ άλλα συστήματα της ίδιας περιόδου έδειξαν προστασία από κυτταρικό θάνατο προκαλούμενο από υπεροξείδιο του υδρογόνου. Και οι δύο παρατηρήσεις μπορούν να ισχύουν για την ίδια χρωστική σε διαφορετικά οξειδοαναγωγικά περιβάλλοντα, και το αποτέλεσμα DCF από μόνο του δεν μπορεί να δείξει ποιος οξειδωτικός παράγοντας ευθυνόταν για το σήμα. Η σημασία της παλαιότερης εργασίας με μιτοχόνδρια εγκεφάλου είναι ότι αντικατέστησε αυτόν τον προκαταρκτικό έλεγχο με μια βαθμονομημένη μέτρηση υπεροξειδίου του υδρογόνου και κατέδειξε άμεσα την επιβάρυνση: ακόμη και εκατό νανομοριακά χρωστικής αύξησαν την απελευθέρωση υπεροξειδίου του υδρογόνου κατά αρκετές φορές, με κάθε υπόστρωμα και σε κάθε αναπνευστική κατάσταση που εξετάστηκε.

Το DCFDA ενέχει ακόμη μία παγίδα ειδικά για το κυανό του μεθυλενίου. Η χρωστική έχει έντονο χρώμα και είναι οξειδοαναγωγικά ενεργή, επομένως μπορεί να προκαλέσει λεύκανση του φθορισμού, απόσβεση της εκπομπής ή οξείδωση του ανιχνευτή ανεξάρτητα από τις κυτταρικές ROS. Ένας έλεγχος χωρίς κύτταρα, με χρωστική και ανιχνευτή, δεν είναι προαιρετική διακοσμητική προσθήκη. Είναι το πείραμα που σας δείχνει αν η χρωστική αλληλεπιδρά με τον ανιχνευτή.

Παγίδευση σπιν και κατανάλωση οξυγόνου: ταυτότητα και ροή

Ενώ οι φθορίζοντες ανιχνευτές δείχνουν ότι εμφανίστηκε κάτι οξειδώσιμο, ο συντονισμός ηλεκτρονικού σπιν με παγίδες σπιν δίνει πληροφορίες πιο κοντά στην ταυτότητά του. Η κλασική μελέτη της φωτοχημείας του κυανού του μεθυλενίου χρησιμοποίησε ESR για να ανιχνεύσει τη ρίζα ασκορβικού από χρωστική, ασκορβικό και φως, και στη συνέχεια έδειξε σχηματισμό υπεροξειδίου του υδρογόνου σε πειράματα κατανάλωσης οξυγόνου και σχηματισμό ριζών υδροξυλίου καταλυόμενο από σίδηρο σε πειράματα παγίδευσης σπιν. Κάθε τεχνική απάντησε στο ερώτημα που οι άλλες δεν μπορούσαν να απαντήσουν: το ESR έδωσε την ταυτότητα της ρίζας, η κατανάλωση οξυγόνου έδωσε τη ροή της αντίδρασης ανεξάρτητα από οποιονδήποτε φθορίζοντα ανιχνευτή, και ο συνδυασμός έδειξε ότι τόσο η οδός του μονήρους οξυγόνου όσο και οι οδοί των ριζών λειτουργούσαν στο ίδιο φωτιζόμενο σύστημα.

Εκείνο το αποτέλεσμα του 1984 εξακολουθεί να διαβάζεται σαν προειδοποιητική ετικέτα. Με φωτισμό και παρουσία αναγωγικού παράγοντα, η χρωστική παρήγαγε υπεροξείδιο του υδρογόνου, και με παρουσία σιδήρου το σύστημα παρήγαγε τη ρίζα υδροξυλίου, την πιο δραστική μορφή της ομάδας. Οι συγγραφείς συνέδεσαν αυτό το εύρημα με το ασκορβικό στο μάτι και αμφισβήτησαν την αβασάνιστη οφθαλμική χρήση. Οι σημερινοί αναγνώστες θα πρέπει να προσέξουν τις συνθήκες: φως συν αναγωγικός παράγοντας συν σίδηρος. Αν αφαιρεθεί οποιοδήποτε από αυτά, η οδός εξασθενεί ή εξαφανίζεται.

Τα ηλεκτρόδια οξυγόνου δικαιολογούν τη θέση τους με διαφορετικό τρόπο. Ένα ηλεκτρόδιο τύπου Clark μετρά την καθαρή κατανάλωση οξυγόνου, αποδεικνύοντας ότι η οξειδοαναγωγική χημεία που προκαλεί η χρωστική καταναλώνει μοριακό οξυγόνο και παρέχοντας κινητικά δεδομένα που κανένα τεχνούργημα φθορισμού δεν μπορεί να μιμηθεί. Δεν ταυτοποιεί το προϊόν. Ο σχηματισμός υπεροξειδίου του υδρογόνου, υπεροξειδίου του ανιόντος οξυγόνου και νερού, καθώς και η αποδιέγερση του μονήρους οξυγόνου, καταναλώνουν όλα οξυγόνο. Η ροή χωρίς ταυτότητα είναι εξίσου ελλιπής με την ταυτότητα χωρίς ροή, γι’ αυτό οι ισχυρά τεκμηριωμένες εργασίες συνδυάζουν το ηλεκτρόδιο με μια βαθμονομημένη δοκιμασία υπεροξειδίου του υδρογόνου ή με μια παγίδα.

Γιατί τα αντιοξειδωτικά αποτελέσματα συγκρούονται

Αν εξεταστούν οι τρεις μετρήσεις δίπλα δίπλα, οι φαινομενικές αντιφάσεις στη βιβλιογραφία του κυανού του μεθυλενίου εξηγούνται από διαφορές στις μεθόδους και από τρία βιολογικά δεδομένα.

Πρώτον, η χρωστική είναι ταυτόχρονα φορέας ηλεκτρονίων και πηγή υπεροξειδίου του υδρογόνου. Εκτρέποντας ηλεκτρόνια μακριά από τις αναπνευστικές θέσεις όπου το οξυγόνο θα μετατρεπόταν διαφορετικά σε υπεροξείδιο του ανιόντος οξυγόνου, μπορεί να μειώσει μία ROS, ενώ η ανηγμένη μορφή της ανάγει το οξυγόνο απευθείας σε υπεροξείδιο του υδρογόνου, αυξάνοντας μια άλλη. Ένα εργαστήριο που μελετά τη μιτοχονδριακή οξειδοαναγωγική χημεία και τον ρόλο της χρωστικής ως παράκαμψης θα πρέπει επομένως να αναμένει απαντήσεις που εξαρτώνται από τον ανιχνευτή: μια μέτρηση ευαίσθητη στο υπεροξείδιο του ανιόντος οξυγόνου μειώνεται, ενώ μια μέτρηση υπεροξειδίου του υδρογόνου αυξάνεται στην ίδια κυψελίδα.

Δεύτερον, το υπεροξείδιο του υδρογόνου σε χαμηλές δόσεις είναι σήμα, όχι μόνο βλάβη. Η μελέτη μιτοχονδρίων εγκεφάλου ποντικού που ακολούθησε την προηγούμενη εργασία διαπίστωσε παραγωγή υπεροξειδίου του υδρογόνου ακόμη και με πενήντα νανομοριακά χρωστικής, χωρίς βλάβες στο μιτοχονδριακό DNA σε θεραπευτικά επίπεδα, με προστασία από βλάβες προκαλούμενες από ροτενόνη μετά από προεπεξεργασία. Μόνο στα εκατό μικρομοριακά, πολύ πάνω από το θεραπευτικό εύρος, η χρωστική προκάλεσε βλάβη σε επιλεγμένα τμήματα DNA, ενώ ερυθρό φως μαζί με είκοσι μικρομοριακά χρωστικής παρήγαγαν μονήρες οξυγόνο που προκάλεσε βλάβη σε όλα τα τμήματα που εξετάστηκαν. Ο προτεινόμενος μηχανισμός είναι ορμητικός: η ήπια παραγωγή υπεροξειδίου του υδρογόνου ενεργοποιεί αντιοξειδωτικές άμυνες που συνδέονται με τον Nrf2 και μιτοχονδριακή βιογένεση, οπότε μια βραχυπρόθεσμη προοξειδωτική μέτρηση προηγείται ενός πιο μακροπρόθεσμου αντιοξειδωτικού αποτελέσματος. Μια δοκιμασία που διαβάζεται στη μία ώρα και μια δοκιμασία που διαβάζεται στη μία ημέρα μπορεί να διαφωνούν, επειδή η βιολογία άλλαξε στο μεταξύ.

Τρίτον, το φως καθορίζει ακόμη και ποιο μόριο είναι παρόν. Ο φωτισμός απομεθυλιώνει τη χρωστική προς Azure B και συναφή προϊόντα, και η λυχνία του μικροσκοπίου πάνω από ένα τρυβλίο αρκεί για να την ενεργοποιήσει ως φωτοευαισθητοποιητή. Τα πειράματα στο σκοτάδι και υπό φωτισμό είναι διαφορετικά πειράματα, και η ενότητα για τους ελέγχους φωτισμού και χειρισμού της χρωστικής σε κάθε πρωτόκολλο θα πρέπει να τα αντιμετωπίζει έτσι.

Ένα ελάχιστο σύνολο ελέγχων και πώς να ερμηνεύετε κάθε ισχυρισμό

Η παρακάτω σύγκριση αποτελεί το πρωτότυπο υλικό αναφοράς αυτού του άρθρου. Πριν αποδεχτείτε οποιοδήποτε αποτέλεσμα ROS για το κυανό του μεθυλενίου, ελέγξτε ποια γραμμή κάλυψαν οι συγγραφείς και ποια παρέλειψαν.

Από αυτά προκύπτει ένας πρακτικός κανόνας ερμηνείας. Το Amplex με υπεροξειδάση, βαθμονομημένο και με έλεγχο καταλάσης, παρέχει στοιχεία για το υπεροξείδιο του υδρογόνου. Το DCFDA παρέχει στοιχεία για μη ειδική οξείδωση του ανιχνευτή και τίποτε περισσότερο. Η παγίδευση σπιν με ελέγχους δέσμευσης ριζών παρέχει στοιχεία για την ταυτότητα των ριζών. Η κατανάλωση οξυγόνου παρέχει στοιχεία για τη ροή. Μια πρόταση που ισχυρίζεται περισσότερα από όσα μπορεί να στηρίξει η δοκιμασία της, όσο βέβαια κι αν είναι διατυπωμένη, είναι μια πρόταση για τον ανιχνευτή, όχι για τη χρωστική. Συναφείς συζητήσεις για την εξάρτηση από τη δόση και το ορμητικό εύρος, τη μιτοχονδριακή ροή ηλεκτρονίων, την παρεμβολή στις δοκιμασίες σε χρωσμένα δείγματα και τα τεχνουργήματα φωτισμού στη μικροσκοπία επεκτείνουν καθένα από αυτά τα σημεία, και καθένα παραμένει έγκυρο όταν η προσωρινή παραπομπή του αντικατασταθεί.