Μέτρηση των μιτοχονδριακών επιδράσεων του κυανού του μεθυλενίου: οξυγόνο, ATP και δυναμικό μεμβράνης

Ας υποθέσουμε ότι ένα εργαστήριο προσθέτει κυανό του μεθυλενίου σε μιτοχόνδρια με διαταραγμένη αναπνοή και παρατηρεί αύξηση της κατανάλωσης οξυγόνου. Η αυθόρμητη διατύπωση είναι ότι η χρωστική αποκατέστησε τη μιτοχονδριακή λειτουργία. Αυτή η διατύπωση μπορεί να είναι λανθασμένη. Η ροή οξυγόνου, η σύνθεση ATP και το δυναμικό μεμβράνης είναι τρεις διακριτές έννοιες. Αφορούν το ίδιο οργανίδιο όπως η δημιουργία αντιγράφων ασφαλείας, ο συγχρονισμός και η κοινή χρήση αφορούν τον ίδιο φάκελο στο νέφος: σχετίζονται, αλλά διέπονται από διαφορετικούς κανόνες. Αν συγχέονται μεταξύ τους, η ερμηνεία καταρρέει, ακόμη κι όταν κάθε μέτρηση είναι τεχνικά σωστή.

Το κυανό του μεθυλενίου ευνοεί αυτή τη σύγχυση επειδή συμμετέχει στο σύστημα που μετρά. Είναι μια ουσία που εκτελεί οξειδοαναγωγικούς κύκλους, δεχόμενη ηλεκτρόνια σε ανάντη σημεία και παραδίδοντάς τα σε κατάντη σημεία, ένα λιπόφιλο κατιόν που συσσωρεύεται σε ενεργοποιημένα μιτοχόνδρια και μια έντονα κυανή ένωση που απορροφά και εκπέμπει φως στις ίδιες φασματικές ζώνες με συνήθεις ανιχνευτές. Μια μόνο μετρούμενη παράμετρος δεν αρκεί για όλα αυτά. Η αξιόπιστη προσέγγιση, όπως φαίνεται στις μιτοχονδριακές μελέτες της ομάδας της Βουδαπέστης, είναι η μέτρηση της ροής οξυγόνου μαζί με τον ρυθμό σύνθεσης ATP, το δυναμικό μεμβράνης και την απελευθέρωση υπεροξειδίου του υδρογόνου, με ελέγχους ειδικούς για τη χρωστική σε κάθε βήμα.

Η αναπνευσιομετρία μετρά τη ροή οξυγόνου, όχι την ενεργειακή απόδοση

Η αναπνευσιομετρία υψηλής ανάλυσης, είτε με Oroboros Oxygraph είτε με αναλυτή εξωκυττάριας ροής Seahorse, αναφέρει ένα πράγμα: πόσο γρήγορα ανάγεται το οξυγόνο. Δεν αναφέρει πόσα πρωτόνια αντλήθηκαν ανά ηλεκτρόνιο, πόσο από τη βαθμίδα διατηρήθηκε ή αν την αξιοποίησε η συνθάση του ATP.

Η ορολογία έχει σημασία. Σε απομονωμένα μιτοχόνδρια, το υπόστρωμα χωρίς ADP δίνει αναπνοή λόγω διαρροής, το υπόστρωμα με ADP σε συγκέντρωση κορεσμού δίνει την ικανότητα οξειδωτικής φωσφορυλίωσης και η τιτλοδότηση με αποσυζεύκτη δίνει τη μέγιστη ικανότητα μεταφοράς ηλεκτρονίων. Σε ακέραια κύτταρα, οι αντίστοιχες παράμετροι του Seahorse είναι η βασική αναπνοή, η συνδεδεμένη με ATP αναπνοή που είναι ευαίσθητη στην ολιγομυκίνη, η διαρροή πρωτονίων, η μέγιστη αναπνοή όπως προσδιορίζεται με FCCP και η μη μιτοχονδριακή κατανάλωση οξυγόνου που είναι ανθεκτική στη ροτενόνη μαζί με αντιμυκίνη. Η ονομασία των αποτελεσμάτων του Seahorse ως Κατάσταση 3 και Κατάσταση 4 υπονοεί μια ακρίβεια που δεν υποστηρίζεται από το παρασκεύασμα, όπως διευκρινίζει το πλαίσιο Mito Stress Test της Agilent.

Το κυανό του μεθυλενίου διαρρηγνύει τη διαισθητική σύνδεση ανάμεσα σε περισσότερο οξυγόνο και περισσότερη ενέργεια. Σε απομονωμένα μιτοχόνδρια εγκεφάλου ινδικού χοιριδίου, χρωστική σε συγκεντρώσεις από 100 nM έως 1 uM αύξησε την κατανάλωση οξυγόνου σε ηρεμία με υποστρώματα γλουταμικό μαζί με μηλικό, ηλεκτρικό και άλφα-γλυκεροφωσφορικό, με αύξηση περίπου 64 τοις εκατό στο άλφα-γλυκεροφωσφορικό. Ωστόσο, η αναπνοή που διεγείρεται από ADP σε υγιή μιτοχόνδρια παρέμεινε ουσιαστικά αμετάβλητη, σύμφωνα με τη μελέτη απομονωμένων μιτοχονδρίων εγκεφάλου. Επειδή η διαρροή αυξήθηκε ενώ η ροή που διεγείρεται από ADP παρέμεινε σταθερή, ο υπολογιζόμενος λόγος αναπνευστικού ελέγχου μειώνεται. Αυτή η μείωση δεν σημαίνει ότι η χρωστική προκάλεσε βλάβη στα μιτοχόνδρια. Σημαίνει ότι η χρωστική πρόσθεσε έναν οξειδοαναγωγικό κύκλο που καταναλώνει οξυγόνο, επιπλέον της φυσιολογικής αναπνοής. Μια δοκιμασία κατανάλωσης οξυγόνου με κυανό του μεθυλενίου που αναφέρει μόνο την αύξηση έχει μετρήσει μια πραγματική χημική διεργασία, χωρίς να πει τίποτε για τη διατήρηση της ενέργειας.

Τα πειράματα αποκατάστασης δείχνουν την ίδια απόκλιση σε μεγαλύτερη κλίμακα. Με αναστολή του Συμπλόκου I, η ροή οξυγόνου αυξήθηκε κατά την αποκατάσταση περίπου τριπλάσια, ενώ η σύνθεση ATP αυξήθηκε μόνο περίπου κατά 1.5 φορά. Περισσότερο οξυγόνο έφτασε στο ηλεκτρόδιο. Μικρότερο μέρος του χρησιμοποιήθηκε για παραγωγή ATP. Κάθε ισχυρισμός για βελτιωμένη οξειδωτική φωσφορυλίωση χρειάζεται και τα δεδομένα του ATP, ιδανικά εκφρασμένα ως λόγος ATP ανά οξυγόνο, με σαφή δήλωση της σύμβασης που χρησιμοποιείται για τον παρονομαστή.

Οι δοκιμασίες ATP μετρούν τον ρυθμό σύνθεσης, τον οποίο δεν μπορεί να υποκαταστήσει η περιεκτικότητα

Μια δοκιμασία ATP απαντά σε διαφορετικό ερώτημα: πόσο ATP παράγεται ανά μονάδα χρόνου. Μια κινητική μέτρηση, είτε μέσω φωταύγειας λουσιφεράσης πυγολαμπίδας που παρακολουθείται επί λεπτά είτε μέσω συζευγμένης δοκιμασίας εξοκινάσης και αφυδρογονάσης της 6-φωσφορικής γλυκόζης με ανάγνωση στα 340 nm, δίνει έναν ρυθμό. Μια μεμονωμένη μέτρηση τελικού σημείου του συνολικού ATP δίνει την περιεκτικότητα, η οποία αντανακλά τη σύνθεση μείον την κατανάλωση και από μόνη της λέει ελάχιστα για την οξειδωτική φωσφορυλίωση.

Η ομάδα της Βουδαπέστης χρησιμοποίησε τη συζευγμένη ενζυμική μέθοδο με καταστολή της αδενυλικής κινάσης και διαπίστωσε ότι το κυανό του μεθυλενίου σε συγκεντρώσεις από 1 έως 2 uM αύξησε μέτρια αλλά στατιστικά σημαντικά την παραγωγή ATP σε μιτοχόνδρια που είχαν υποβληθεί σε επεξεργασία με ροτενόνη και αντιμυκίνη. Πρόκειται για πραγματική αποκατάσταση, αλλά είναι μερική. Η μελέτη τοξικότητας του TEGDMA κατέληξε σε παρόμοιο αποτέλεσμα σε διαφορετικό μοντέλο: το οδοντιατρικό μονομερές TEGDMA σε συγκέντρωση 5 mM μείωσε δραστικά την αναπνοή που συνδέεται με το Σύμπλοκο I, από περίπου 286 σε 28 μονάδες ροής, και η χρωστική σε συγκέντρωση 2 uM την επανέφερε περίπου στις 86.

Δύο έλεγχοι είναι απολύτως απαραίτητοι όταν χρησιμοποιείται μια έγχρωμη οξειδοαναγωγική ένωση. Πρώτον, χρησιμοποιήστε ολιγομυκίνη για να προσδιορίσετε πόσο από τη μετρούμενη σύνθεση ATP εξαρτάται από τη συνθάση του ATP. Δεύτερον, πραγματοποιήστε έλεγχο ανάκτησης προστιθέμενης γνωστής ποσότητας ATP σε σύστημα χωρίς κύτταρα, με το πλήρες αντιδραστήριο και τις ακριβείς συγκεντρώσεις χρωστικής που χρησιμοποιούνται, τουλάχιστον 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM και 2 uM. Η χρωστική μπορεί να απορροφά το εκπεμπόμενο φως, να αναστέλλει το ένζυμο αναφοράς ή να μεταβάλλει την οξειδοαναγωγική χημεία του αντιδραστηρίου, και οι γενικές οδηγίες για δοκιμασίες λουσιφεράσης συνιστούν συμπληρωματικούς βιοχημικούς ελέγχους ακριβώς για αυτή την κατηγορία παρεμβολών. Μην υποθέτετε ότι η συγκέντρωση 1 uM είναι απαλλαγμένη από τεχνουργήματα επειδή η απόσβεση είναι συνήθως εντονότερη σε υψηλότερες συγκεντρώσεις.

Οι ανιχνευτές δυναμικού μεμβράνης μετρούν την κατανομή της χρωστικής, όχι τη ροή

Η σαφρανίνη O, τα TMRM και TMRE, η ροδαμίνη 123 και το JC-1 είναι όλα κατιόντα που διαπερνούν τις μεμβράνες. Συσσωρεύονται στην αρνητικά φορτισμένη μιτοχονδριακή μήτρα σύμφωνα με την ηλεκτροχημική ισορροπία, οπότε ο συνολικός φθορισμός αντανακλά έμμεσα το δυναμικό μέσω της θέσης όπου βρίσκεται ο ανιχνευτής. Κανένα από αυτά δεν μετρά ATP ή ροή ηλεκτρονίων.

Κάθε ανιχνευτής είναι καταλληλότερος για συγκεκριμένο παρασκεύασμα. Η σαφρανίνη O είναι κατάλληλη για απομονωμένα μιτοχόνδρια και διαπερατοποιημένα κύτταρα, συνήθως σε συγκέντρωση κοντά στα 2 uM, με διέγερση κοντά στα 495 nm και εκπομπή κοντά στα 585 nm. Λειτουργεί σε καθεστώς απόσβεσης, όπου η πρόσληψή της μεταβάλλει τον συνολικό φθορισμό. Τα TMRM και TMRE είναι κατάλληλα για ακέραια κύτταρα με χαμηλή φόρτωση, σε νανομοριακές συγκεντρώσεις και σε λειτουργία χωρίς απόσβεση, όπου η αποπόλωση απελευθερώνει τη χρωστική και ο μιτοχονδριακός φθορισμός μειώνεται· σε υψηλή φόρτωση, η κατεύθυνση του σήματος μπορεί να αντιστραφεί λόγω αυτοαπόσβεσης. Το JC-1 δίνει έναν εύχρηστο λόγο πράσινου προς κόκκινο φθορισμό, αλλά εξαρτάται από τη φόρτωση και τη μιτοχονδριακή μάζα, γεγονός που το καθιστά λιγότερο κατάλληλο για ποσοτική εργασία από το TMRM υπό προσεκτικά ελεγχόμενες συνθήκες. Αυτά τα πλεονεκτήματα και οι περιορισμοί συνοψίζονται σε μια ευρέως χρησιμοποιούμενη ανασκόπηση ανιχνευτών μιτοχονδριακού δυναμικού μεμβράνης.

Το κυανό του μεθυλενίου προκαλεί οπτικές παρεμβολές ακριβώς στις συγκεντρώσεις εργασίας. Οι ζώνες απορρόφησής του κοντά στα 600 έως 665 nm επικαλύπτονται με την κόκκινη εκπομπή των ανιχνευτών, οπότε τα φαινόμενα εσωτερικού φίλτρου, η απόσβεση και η απορρόφηση του φωτός διέγερσης είναι όλα πιθανά. Η χρωστική είναι επίσης ένα δεύτερο λιπόφιλο κατιόν, του οποίου η ίδια η κατανομή μεταβάλλεται ανάλογα με το δυναμικό που μετράται. Η προστασία έγκειται στις πολλαπλές μετρήσεις και στα τυφλά δείγματα: ανιχνευτής μόνος του, χρωστική μόνη της, ανιχνευτής μαζί με κάθε συγκέντρωση χρωστικής, πλήρης αποπόλωση με FCCP ως μηδενική αναφορά και, ιδανικά, ένας δεύτερος ανιχνευτής με διαφορετικά οπτικά χαρακτηριστικά. Η μελέτη παράκαμψης του Συμπλόκου III καθιέρωσε αυτό το προηγούμενο, επαναλαμβάνοντας την αποκατάσταση του δυναμικού μεμβράνης τόσο με σαφρανίνη O όσο και με TMRM μετά από αναστολή με αντιμυκίνη και μυξοθειαζόλη και καταγράφοντας την ίδια ποιοτική αποκατάσταση. Ένας οπτικός δείκτης αποτελεί ένδειξη. Δύο ανεξάρτητοι δείκτες αποτελούν τεκμηρίωση.

Τρία παρασκευάσματα, τρία διαφορετικά ερωτήματα

Τα απομονωμένα μιτοχόνδρια, τα διαπερατοποιημένα κύτταρα και τα ακέραια κύτταρα δεν είναι εναλλάξιμες ρυθμίσεις ευαισθησίας της ίδιας δοκιμασίας. Είναι διαφορετικές προσεγγίσεις με διαφορετικές αρχές λειτουργίας.

Τα απομονωμένα μιτοχόνδρια διατηρούν την αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων, την εσωτερική μεμβράνη και τον λειτουργικό μηχανισμό της μήτρας, ενώ απομακρύνονται η πλασματική μεμβράνη, το κυτταρόπλασμα και η αρχιτεκτονική του δικτύου. Αυτή η απομάκρυνση είναι ο σκοπός: τα υποστρώματα, το ADP, οι αναστολείς και οι συγκεντρώσεις της χρωστικής καθορίζονται με ακρίβεια, ώστε να μπορεί να προσδιοριστεί μια οδός. Το τίμημα είναι η απώλεια της φυσικής παροχής υποστρωμάτων, της σηματοδότησης και της ενεργειακής ζήτησης.

Τα διαπερατοποιημένα κύτταρα διατηρούν τα μιτοχόνδρια μέσα σε μεγάλο μέρος της κυτταρικής τους αρχιτεκτονικής, επιτρέποντας παράλληλα τη διέλευση εξωγενών υποστρωμάτων και ADP μέσω της πλασματικής μεμβράνης που έχει καταστεί διαπερατή. Είναι το κατάλληλο εργαλείο για τον εντοπισμό ενός ελαττώματος σε οδό χρήσης υποστρώματος μέσα σε κυτταρικό πλαίσιο. Η υπερβολική διαπερατοποίηση βλάπτει την εξωτερική μεμβράνη και η κυτταροπλασματική ρύθμιση χάνεται με την έκπλυση.

Τα ακέραια κύτταρα διατηρούν τα πάντα: τον φραγμό της πλασματικής μεμβράνης, τους κυτταροπλασματικούς αναγωγικούς παράγοντες, την ενδογενή μεταφορά υποστρωμάτων, το μιτοχονδριακό δίκτυο και τη ζήτηση ATP. Βρίσκονται πλησιέστερα στη φυσιολογία και μακρύτερα από τη μηχανιστική αποσαφήνιση, επειδή η πρόσληψη, η αναγωγή και η δέσμευση της χρωστικής σε διαμερίσματα διαμορφώνουν όλες την πραγματική έκθεση των μιτοχονδρίων.

Η μελέτη του TEGDMA χρησιμοποίησε σκόπιμα και τα τρία επίπεδα: απομονωμένα μιτοχόνδρια εγκεφάλου για την αποκατάσταση της οξείδωσης και του δυναμικού με τη χρωστική, διαπερατοποιημένα βλαστοκύτταρα οδοντικού πολφού κυρίως για τον εντοπισμό της βλάβης στην οξείδωση υποστρωμάτων που συνδέεται με το Σύμπλοκο I και ακέραια βλαστοκύτταρα για τη συνολική φυσιολογική επίδραση της χρωστικής σε συγκέντρωση 2 uM στην κατασταλμένη κατανάλωση οξυγόνου. Για τους αναγνώστες που συγκρίνουν μιτοχονδριακές μετρήσεις μεταξύ παρασκευασμάτων, το συνοδευτικό επεξηγηματικό άρθρο για το πώς το κυανό του μεθυλενίου μεταφέρει ηλεκτρόνια μέσω της αναπνευστικής αλυσίδας παρέχει το υπόβαθρο των οδών, ενώ ο οδηγός ανάγνωσης μελετών αναπνοής με κυανό του μεθυλενίου καλύπτει τη λογική των δόσεων και των αναστολέων.

Έλεγχοι που απαιτεί μια οξειδοαναγωγικά ενεργή χρωστική

Μια ουσία που εκτελεί οξειδοαναγωγικούς κύκλους χρειάζεται μεγαλύτερο κατάλογο ελέγχων από έναν συνηθισμένο αναστολέα, επειδή η χημεία της χρωστικής από μόνη της μπορεί να μιμηθεί βιολογικές διεργασίες.

Για την αναπνευσιομετρία, χρησιμοποιήστε έναν θάλαμο μόνο με ρυθμιστικό διάλυμα για τον έλεγχο της ολίσθησης του σήματος, έναν θάλαμο με ρυθμιστικό διάλυμα και χρωστική χωρίς βιολογικό υλικό, χρωστική μαζί με κάθε εξωκυττάριο αναγωγικό παράγοντα που υπάρχει στη δοκιμασία και, στο τέλος, ροτενόνη μαζί με αντιμυκίνη για να ορίσετε τη μη μιτοχονδριακή κατανάλωση οξυγόνου στα ακέραια κύτταρα. Σημειώστε ότι η ανηγμένη χρωστική επανοξειδώνεται μεταφέροντας ηλεκτρόνια στο οξυγόνο και σχηματίζοντας υπεροξείδιο του υδρογόνου. Επομένως, ένα τυφλό δείγμα μόνο με χρωστική, χωρίς δότη ηλεκτρονίων, υποεκτιμά την κατανάλωση οξυγόνου χωρίς κύτταρα που εμφανίζεται μόλις καταστεί διαθέσιμο NADH ή NADPH.

Για το υπεροξείδιο του υδρογόνου, προτιμήστε βαθμονομημένο Amplex UltraRed μαζί με υπεροξειδάση χρένου αντί για μη εκλεκτικές χρωστικές DCFDA, επιβεβαιώστε με καταλάση και ελέγξτε την εξάρτηση από τον φωτισμό, καθώς η χρωστική είναι φωτοευαισθητοποιητής. Η μελέτη των μιτοχονδρίων εγκεφάλου διαπίστωσε ότι η επιβάρυνση από υπεροξείδιο αυξήθηκε περισσότερο από τετραπλάσια με μόλις 100 nM χρωστικής, ενώ η απομάκρυνσή του επιβραδύνθηκε, και ότι το υπεροξείδιο σχηματιζόταν απευθείας από την ανηγμένη χρωστική χωρίς ενδιάμεσο υπεροξείδιο ανιόν. Οι λεπτομέρειες για την επιλογή ανιχνευτή και τους ελέγχους φωτισμού περιλαμβάνονται στο συνοδευτικό άρθρο για τη μέτρηση δραστικών μορφών οξυγόνου σε πειράματα με χρωστικές, ενώ το ευρύτερο ερώτημα του πότε το υπεροξείδιο λειτουργεί ως σήμα και πότε ως επιβάρυνση καλύπτεται μαζί με την κυτταρική οξειδοαναγωγική ισορροπία και τους ισχυρισμούς περί αντιοξειδωτικής δράσης.

Για ισχυρισμούς σχετικά με τις οδούς, εξετάστε και τις δύο θέσεις αναστολής του Συμπλόκου III: αντιμυκίνη A στη θέση Qi και μυξοθειαζόλη στη θέση Qo, καθώς και αναστολή του Συμπλόκου IV με κυανιούχο ως τελικό έλεγχο. Μια παλαιότερη μελέτη εγκεφάλου ποντικού ανέφερε αποκατάσταση από τη χρωστική της αναπνοής που είχε ανασταλεί με ροτενόνη, αλλά όχι εκείνης που είχε ανασταλεί με αντιμυκίνη. Αντίθετα, η μεταγενέστερη μελέτη σε τρία είδη βρήκε μερική αποκατάσταση και με τους δύο αναστολείς, καθώς και ενδείξεις άμεσης αναγωγής του κυτοχρώματος c. Θεωρήστε την παράκαμψη συμβατή με τα νεότερα δεδομένα και όχι οριστικά τεκμηριωμένη, καθώς η συγκέντρωση της χρωστικής, η θέση δράσης του αναστολέα, η κατάσταση των υποστρωμάτων και η κατανομή της χρωστικής μεταβάλλουν όλες την παρατηρούμενη οδό.

Πίνακας επιλογής δοκιμασιών

Χρησιμοποιήστε αυτόν τον πίνακα για να επιλέξετε τη μέτρηση με βάση το ερώτημα, όχι το αντίστροφο.

Η ελάχιστη πειραματική τεκμηρίωση ενός πειστικού ισχυρισμού εξετάζει τις ίδιες συγκεντρώσεις χρωστικής, 100 nM, 300 nM, 1 uM και 2 uM, ως προς τη ροή οξυγόνου σε συνθήκες διαρροής, ADP, ολιγομυκίνης και αποσυζεύκτη, τον ρυθμό σύνθεσης ATP, το δυναμικό μεμβράνης κατά προτίμηση με δύο ανιχνευτές και τη βαθμονομημένη απελευθέρωση υπεροξειδίου με καταλάση και ελέγχους χωρίς κύτταρα. Αναφέρετε το συνδεδεμένο σύνολο: ροή οξυγόνου μαζί με ρυθμό ATP, ATP ανά οξυγόνο, δυναμικό και υπεροξείδιο. Οποιοσδήποτε από αυτούς τους αριθμούς μόνος του είναι μια μέτρηση που αναζητά το νόημά της.