Το κυανό του μεθυλενίου στην έρευνα σε ζεβρόψαρα: πρόσθετο εκτροφής και πειραματικός συγχυτικός παράγοντας

Το νερό των αυγών ζεβρόψαρων είναι συχνά ελαφρώς γαλάζιο και σχεδόν κανείς δεν καταγράφει τον λόγο. Η χρωστική είναι το κυανό του μεθυλενίου, που προστίθεται κατά των μυκήτων, και τα περισσότερα πρωτόκολλα το αντιμετωπίζουν ως μέρος του υποβάθρου. Το υπόβαθρο είναι η λάθος έννοια εδώ. Καταλληλότερη είναι αυτή ενός μη καταγεγραμμένου πειραματικού παράγοντα: μιας ουσίας που υπάρχει στα τρυβλία έκθεσης και απουσιάζει από τα τρυβλία ελέγχου, είναι φαρμακολογικά ενεργή στις χρησιμοποιούμενες συγκεντρώσεις και μπορεί να μεταβάλει ακριβώς τις καταληκτικές παραμέτρους που μετρά το πείραμα.

Αυτή η διάκριση καθορίζει όλα όσα ακολουθούν. Η συνήθης αντιμυκητιασική φροντίδα κατά την εκτροφή είναι ένα ερώτημα. Το αν το πρόσθετο είναι ουδέτερο ως προς τη δοκιμασία σας είναι διαφορετικό ερώτημα. Η πρόσφατη βιβλιογραφία για τα ζεβρόψαρα απαντά στο πρώτο καθησυχαστικά και στο δεύτερο με τρόπο που προκαλεί προβληματισμό.

Τι προβλέπουν πραγματικά οι κατευθυντήριες οδηγίες

Δεν υπάρχει ένα ενιαίο πρότυπο, και αυτό αποτελεί μέρος του προβλήματος. Οι οδηγίες του Καναδικού Συμβουλίου για τη Φροντίδα των Ζώων επιτρέπουν 0.5 mg/L, ή 0.00005%, στο διάλυμα μεταφοράς αυγών και προνυμφών για τον περιορισμό της ανάπτυξης μυκήτων. Οι ευρωπαϊκές οδηγίες για τα εργαστηριακά ζώα περιγράφουν έμβρυα που διατηρούνται σε μέσο το οποίο συχνά περιέχει την ίδια συγκέντρωση, 0.00005%. Η συνταγή E3 του Cold Spring Harbor ορίζει τη διπλάσια συγκέντρωση, 1 mg/L ή 0.0001%, ως συστατικό της συνταγής. Σε αντίθεση με αυτά, υπάρχει μια αξιοσημείωτη παράλειψη: η κατευθυντήρια οδηγία του OECD για τη δοκιμή τοξικότητας σε έμβρυα ψαριών προβλέπει ανασυσταμένο νερό αραίωσης και την υπό δοκιμή χημική ουσία, χωρίς σύσταση για κυανό του μεθυλενίου ούτε στην έκδοση του 2013 ούτε στη μεταγενέστερη αναθεώρηση. Έτσι, ένα εργαστήριο εκτρέφει έμβρυα ζεβρόψαρων με κυανό του μεθυλενίου σε γαλάζιο νερό από τις πρώτες ώρες ζωής, ένα άλλο εκτελεί τη δοκιμασία εμβρύων για κανονιστικούς σκοπούς σε διαυγές νερό, και τα δύο χαρακτηρίζουν το μέσο τους φυσιολογικό. Όποιος συγκρίνει αποτελέσματα μεταξύ εργαστηρίων ή συνδυάζει ιστορικά δεδομένα ομάδων ελέγχου κληρονομεί αυτή την ασυνέπεια.

Για να γίνουν κατανοητές οι συγκεντρώσεις, το 0.00005% αντιστοιχεί περίπου σε 1.56 micromolar και το 0.0001% περίπου σε 3.13 micromolar. Πρόκειται για χαμηλές τιμές, και είναι δελεαστικό να θεωρηθούν υπερβολικά χαμηλές για να έχουν σημασία. Οι μελέτες που ακολουθούν ελέγχουν ακριβώς αυτή την παραδοχή, στις ίδιες ακριβώς συγκεντρώσεις.

Οι αναγνώστες που προέρχονται από τον χώρο της ενυδρειοφιλίας και όχι του εργαστηρίου συναντούν το ίδιο μόριο σε διαφορετικό πλαίσιο, το οποίο καλύπτεται στον οδηγό για το κυανό του μεθυλενίου στο ενυδρείο. Η χημεία είναι κοινή· η συζήτηση για το πώς η χρωστική μεταφέρει ηλεκτρόνια μέσα στα κύτταρα εξηγεί γιατί μια οξειδοαναγωγικά ενεργή ένωση εμφανίζεται διαρκώς σε δημοσιεύσεις για τον μεταβολισμό. Όσα ακολουθούν αφορούν ειδικά το νερό των αυγών ζεβρόψαρων με κυανό του μεθυλενίου.

Μεταβολισμός: η επίδραση αλλάζει πρόσημο ανάλογα με το στάδιο

Η πιο κατατοπιστική μελέτη εξέθεσε φυσιολογικά αναπτυσσόμενα ζεβρόψαρα από την πρώτη ημέρα ζωής έως τις 5 ημέρες μετά τη γονιμοποίηση και μέτρησε τον οξειδωτικό μεταβολισμό σε κάθε στάδιο, όπως περιγράφει η δημοσιευμένη αναφορά των πειραμάτων μεταβολισμού των εμβρύων. Το μοτίβο αξίζει να διατυπωθεί προσεκτικά, επειδή η κατεύθυνσή του αντιστρέφεται.

Στη 1 ημέρα μετά τη γονιμοποίηση, η βασική κατανάλωση οξυγόνου αυξήθηκε στα εκτεθειμένα έμβρυα και στις δύο συγκεντρώσεις εκτροφής. Στις 2 ημέρες, το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης στην επιφανειακή στιβάδα των προνυμφών ήταν αυξημένο κατά την έκθεση σε 0.00005%, 0.0001% και 0.0003%. Στις 4 έως 5 ημέρες, μετά την εκκόλαψη, το πρόσημο είχε αντιστραφεί: η οξειδωτική ενεργειακή δαπάνη μειώθηκε, είτε η έκθεση ήταν συνεχής από τη γονιμοποίηση είτε οξεία, μόνο από την ημέρα 3 έως την ημέρα 4. Παράλληλα, τα μεταγραφήματα για υπομονάδες των μιτοχονδριακών αναπνευστικών συμπλόκων μειώθηκαν τόσο στη 1 όσο και στις 4 ημέρες, μαζί με μεταγραφήματα που σχετίζονται με τη στεροειδογένεση και τη γλυκονεογένεση.

Δύο ακόμη παρατηρήσεις αποσαφηνίζουν την εικόνα. Η εκκόλαψη έγινε λίγο νωρίτερα στην υψηλότερη συγκέντρωση εκτροφής: τα εκτεθειμένα έμβρυα προηγούνταν στις 2 ημέρες και η ομάδα ελέγχου τα είχε φτάσει έως την ημέρα 3. Επίσης, ο ίδιος ο άξονας απόκρισης στο στρες φαινόταν άθικτος: όταν προνύμφες ηλικίας 5 ημερών υποβλήθηκαν σε στρεσογόνο ερέθισμα μέσω στροβιλισμού, η κορτιζόλη ολόκληρου του σώματος αυξήθηκε φυσιολογικά και στις δύο ομάδες. Επομένως, η χρωστική δεν αποτελεί γενικό αναπτυξιακό δηλητήριο σε αυτές τις δόσεις και δεν καταστέλλει κάθε φυσιολογική απόκριση. Μεταβάλλει τον ενεργειακό μεταβολισμό με τρόπο που εξαρτάται από το στάδιο, αυξάνοντάς τον πριν από την εκκόλαψη και μειώνοντάς τον μετά.

Συμπεριφορά: γιατί δύο μελέτες διαφωνούν και γιατί μπορεί να έχουν και οι δύο δίκιο

Η βιβλιογραφία για τη συμπεριφορά φαίνεται αντιφατική μέχρι να συγκριθούν οι σχεδιασμοί έκθεσης δίπλα δίπλα. Μια μελέτη αναπτυξιακής και συμπεριφορικής ασφάλειας εξέθεσε έμβρυα από περίπου τις 6 ώρες μετά τη γονιμοποίηση σε συγκεντρώσεις έως 10 micromolar, ανανέωνε καθημερινά τα διαλύματα έως την ημέρα 4 και κατόπιν μετέφερε τις προνύμφες σε μέσο χωρίς χρωστική για τις ημέρες 5 και 6, εξετάζοντας την κινητική δραστηριότητα σε δοκιμασία φωτός-σκότους την ημέρα 6. Αποτέλεσμα: καμία σημαντική επίδραση στη θνησιμότητα, την εκκόλαψη ή τη μορφολογία και καμία επίδραση της έκθεσης στην κινητική δραστηριότητα. Οι συγγραφείς εύλογα συνέστησαν τα 10 micromolar ως ανώτατο όριο υπό τις συνθήκες τους.

Μια δεύτερη ομάδα, με ορισμένους κοινούς συγγραφείς με τη μελέτη μεταβολισμού, πραγματοποίησε την έκθεση όπως εφαρμόζεται στην πράξη κατά την εκτροφή: η χρωστική ήταν παρούσα από τις 2 έως 3 ώρες μετά τη γονιμοποίηση, με καθημερινή μερική ανανέωση, και η συμπεριφορά μετρήθηκε ενώ η έκθεση συνεχιζόταν ή είχε πρόσφατα ολοκληρωθεί. Στις ίδιες συνήθεις συγκεντρώσεις, οι προνύμφες εμφάνισαν μειωμένη κινητική δραστηριότητα σε δοκιμασία 24 ωρών, εύρημα που αναπαράχθηκε σε διαφορετικά στελέχη και εργαστήρια. Η μελέτη της συγχυτικής επίδρασης στη συμπεριφορά συνέδεσε την επίδραση με τον σεροτονινεργικό τόνο, σε συμφωνία με τη γνωστή αναστολή της μονοαμινοξειδάσης από τη χρωστική. Το πιο ενδεικτικό εύρημα ήταν ότι το μέσο εμβρύων που περιείχε κυανό του μεθυλενίου απέκρυπτε την αναμενόμενη απόκριση της κινητικής δραστηριότητας στον SSRI φλουοξετίνη. Επομένως, μια δοκιμασία διαλογής που εκτελείται σε γαλάζιο νερό μπορεί να μην εντοπίσει μια φαρμακευτική επίδραση που θα αναδεικνυόταν σε διαυγές νερό.

Δεν υπάρχει πραγματική αντίφαση. Μια ένωση μπορεί να μην αφήνει ανιχνεύσιμη υπολειμματική επίδραση δύο ημέρες μετά την απομάκρυνσή της σε μια δοκιμασία και παρ’ όλα αυτά να είναι ενεργή όσο παραμένει παρούσα σε μια άλλη. Η πρακτική ερμηνεία είναι ότι το μηδενικό αποτέλεσμα στηρίζει ένα ανώτατο όριο συγκέντρωσης, όχι έναν ισχυρισμό ουδετερότητας, ενώ το θετικό αποτέλεσμα περιγράφει τον ουσιαστικό κίνδυνο: ενεργή έκθεση κατά το χρονικό παράθυρο της μέτρησης, με την ίδια ακριβώς διάταξη που χρησιμοποιούν τα περισσότερα εργαστήρια.

Μια οξειδοαναγωγική χρωστική μέσα σε μια οξειδοαναγωγική δοκιμασία

Μια ακόμη παγίδα αξίζει ξεχωριστή παράγραφο, επειδή αλλοιώνει το μέσο μέτρησης και όχι το ζώο. Η δοκιμασία ενεργειακής δαπάνης Alamar Blue βασίζεται η ίδια στην οξειδοαναγωγική χημεία: η ρεσαζουρίνη ανάγεται σε φθορίζουσα ρεσορουφίνη. Το κυανό του μεθυλενίου συμμετέχει επίσης σε οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις. Σε ελέγχους χωρίς κύτταρα, και οι δύο συγκεντρώσεις εκτροφής μείωσαν ελαφρώς αλλά σημαντικά τον φθορισμό του Alamar Blue μετά από 24 ώρες. Στα πειράματα με ζώα, τα εκτεθειμένα έμβρυα εκπλύθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές σε μέσο χωρίς χρωστική πριν από τη δοκιμασία, και η βιολογική επίδραση στις εκκολαφθείσες προνύμφες υπερέβαινε την παρεμβολή που παρατηρήθηκε χωρίς κύτταρα. Επομένως, ισχύουν και τα δύο: τα εκπλυμένα ζώα διατηρούν μια πραγματική μεταβολική επίδραση, ενώ η χρωστική που δεν έχει απομακρυνθεί προσθέτει μια άμεση χημική αλλοίωση της μέτρησης. Οι έλεγχοι πρέπει να διαχωρίζουν τις δύο επιδράσεις, διαφορετικά καμία από τις δύο τιμές δεν έχει νόημα. Οι γενικές οδηγίες για την ερμηνεία αποτελεσμάτων δοκιμασιών που βασίζονται σε χρωστικές έχουν εδώ ιδιαίτερη βαρύτητα.

Χρονολόγιο αναπτυξιακών σταδίων

Το πρωτότυπο υλικό αυτού του άρθρου. Οι συγκεντρώσεις είναι οι δύο τυπικές τιμές εκτροφής, 0.00005% και 0.0001%, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

Το μοτίβο που πρέπει να θυμάστε είναι μια πρώιμη αύξηση και μια μεταγενέστερη μείωση των μεταβολικών καταληκτικών παραμέτρων, με τις συμπεριφορικές επιδράσεις να είναι παρούσες κατά την έκθεση και μη ανιχνεύσιμες μετά την απομάκρυνση της χρωστικής στη μοναδική δοκιμασία που το εξέτασε.

Λίστα ελέγχου για τον σχεδιασμό των ομάδων ελέγχου

Το δεύτερο πρωτότυπο υλικό. Χρησιμοποιήστε το όταν τα πρωτόκολλα ζεβρόψαρων με κυανό του μεθυλενίου συνδυάζονται με ένα πείραμα.

1. Καταγράψτε τη χρωστική ως αντιδραστήριο, όχι ως νερό. Αναφέρετε τη συγκέντρωση τόσο σε ποσοστό όσο και σε micromolar, την έναρξη και τη λήξη σε ώρες ή ημέρες μετά τη γονιμοποίηση, το πρόγραμμα ανανέωσης και το διάστημα απομάκρυνσης πριν από κάθε μέτρηση.
2. Προσαρμόστε τις ομάδες ελέγχου στο ερώτημα. Μια μελέτη της υπό δοκιμή χημικής ουσίας χρειάζεται ομάδες ελέγχου χωρίς χρωστική· μια μελέτη εκτροφής χρειάζεται σκέλη χωρίς και με χρωστική, με καταγραφή του αντιμυκητιασικού αποτελέσματος, καθώς καμία από τις αναφερόμενες μελέτες δεν μέτρησε την αντιμυκητιασική αποτελεσματικότητα.
3. Κάντε έκπλυση πριν από τις οξειδοαναγωγικές δοκιμασίες και στη συνέχεια επαληθεύστε. Εκπλύνετε τουλάχιστον τρεις φορές σε μέσο χωρίς χρωστική και εκτελέστε παράλληλα έναν έλεγχο χωρίς κύτταρα που περιέχει χρωστική και αντιδραστήριο, επειδή η χρωστική μειώνει άμεσα το σήμα του Alamar Blue.
4. Αντιμετωπίστε τις συμπεριφορικές παραμέτρους και τις παραμέτρους που σχετίζονται με μονοαμίνες ως υψηλού κινδύνου. Οι μελέτες κινητικής δραστηριότητας, αντίδρασης αιφνιδιασμού, συμπεριφοράς που προσομοιάζει με άγχος, αντικαταθλιπτικών και αναστολέων MAO πρέπει να αποφεύγουν τη χρωστική κατά τη μέτρηση ή να αποδεικνύουν την ουδετερότητά της για τη συγκεκριμένη καταληκτική παράμετρο· η απομάκρυνση για μία έως δύο ημέρες εξάλειψε μία επίδραση στην κινητική δραστηριότητα, αλλά αυτό δεν έχει αποδειχθεί για άλλα πειραματικά μοντέλα.
5. Αντιμετωπίστε τις μεταβολικές και μιτοχονδριακές καταληκτικές παραμέτρους ως υψηλού κινδύνου σε κάθε στάδιο. Η κατανάλωση οξυγόνου, η ενεργειακή δαπάνη, το δυναμικό μεμβράνης και τα μεταγραφήματα της αναπνευστικής αλυσίδας μεταβάλλονται στις συγκεντρώσεις εκτροφής, προς αντίθετες κατευθύνσεις πριν και μετά την εκκόλαψη.
6. Μη μεταφέρετε την παραδοχή ουδετερότητας μεταξύ διαφορετικών σχεδιασμών. Ένα μηδενικό αποτέλεσμα μετά την απομάκρυνση δεν καλύπτει τη συνεχιζόμενη έκθεση· ένα μηδενικό μορφολογικό αποτέλεσμα δεν καλύπτει τον μεταβολισμό ή την αλληλεπίδραση με φάρμακα· ένα αποτέλεσμα σε ένα στέλεχος, μία θερμοκρασία ή μία διάρκεια δοκιμασίας δεν καλύπτει άλλες συνθήκες.
7. Αναφέρετε την κατευθυντήρια οδηγία που ακολουθήσατε και την εναλλακτική της. Κατονομάστε ρητά τις συγκεντρώσεις του CCAC, των ευρωπαϊκών οδηγιών ή του Cold Spring Harbor και επισημάνετε πού η δοκιμή εμβρύων του OECD παραλείπει τη χρωστική, ώστε ο αναγνώστης να μπορεί να κατανοήσει τις συνθήκες στις οποίες διατηρήθηκαν τα ζώα σας.

Τίποτε από αυτά δεν αποτελεί επιχείρημα κατά της χρήσης της χρωστικής για να διατηρούνται τα αυγά ζωντανά. Αποτελεί επιχείρημα κατά της ανεξέταστης μεταφοράς μιας επιλογής εκτροφής στα δεδομένα. Το γαλάζιο μέσα στο τρυβλίο είναι ένα μόριο με φαρμακολογική δράση, και τα πειράματα που είναι πιθανότερο να αλλοιωθούν είναι ακριβώς οι μεταβολικές και νευροσυμπεριφορικές δοκιμασίες διαλογής υψηλής απόδοσης, για τις οποίες προτιμώνται πλέον τα νεαρά ζεβρόψαρα. Καταγράψτε το, ελέγξτε το ως παράγοντα, απομακρύνετέ το πριν από τη μέτρηση και ελέγξτε τη δοκιμασία στην οποία μπορεί να συμμετέχει χωρίς να γίνεται αντιληπτό.