Κυανό του μεθυλενίου και φλεγμονώδης σηματοδότηση: φλεγμονοσώματα, IL-6 και STAT3

Ας υποθέσουμε ότι τρία εργαστήρια αναφέρουν πως η ίδια κυανή ένωση έχει αντιφλεγμονώδη δράση. Το ένα δείχνει λιγότερη IL-1beta από μακροφάγα. Το άλλο δείχνει λιγότερο ένζυμο iNOS στον ίδιο κυτταρικό τύπο. Το τρίτο δείχνει λιγότερη IL-6 στο αίμα και μικρότερη δραστηριότητα του STAT3 στον εγκέφαλο. Είναι δελεαστικό να συγχωνεύσουμε τα τρία αποτελέσματα σε έναν ισχυρισμό. Όμως αυτή η συγχώνευση αποκρύπτει το εύρημα.

Κάθε αποτέλεσμα αφορά διαφορετικό μηχανισμό σηματοδότησης, με το δικό του ερέθισμα, στάδιο συναρμολόγησης και μετρούμενο δείκτη. Το κυανό του μεθυλενίου παρεμβαίνει σε κάθε μηχανισμό σε διαφορετικό σημείο. Το αν οτιδήποτε από αυτά βελτιώνει μια έκβαση υγείας είναι ξεχωριστό ερώτημα, που εξετάζεται στην επισκόπησή μας για το κυανό του μεθυλενίου και τη φλεγμονή. Αυτή η σελίδα περιορίζεται στις οδούς.

Οδός 1: συναρμολόγηση φλεγμονοσώματος και κασπάση-1

Το φλεγμονόσωμα είναι ένα πρωτεϊνικό ικρίωμα που σχηματίζεται όταν χρειάζεται μέσα σε ένα μυελοειδές κύτταρο. Τα συστατικά του είναι ένας αισθητήρας, μια προσαρμοστική πρωτεΐνη που ονομάζεται ASC και ένα εκτελεστικό ένζυμο που ονομάζεται κασπάση-1. Μετά τη συναρμολόγηση, η κασπάση-1 διασπά τις pro-IL-1beta και pro-IL-18 στις εκκρινόμενες μορφές τους και μπορεί να πυροδοτήσει πυρόπτωση, μια φλεγμονώδη μορφή κυτταρικού θανάτου. Ο αισθητήρας καθορίζει τον τύπο: το NLRP3 ανταποκρίνεται σε κρυστάλλους και σε τοξίνες που σχηματίζουν πόρους, όπως η νιγερικίνη, καθώς και στο ATP, το NLRC4 ανταποκρίνεται στη βακτηριακή φλαγγελλίνη, το AIM2 ανταποκρίνεται σε δίκλωνο DNA στο κυτταρόπλασμα και η μη κανονική οδός ανταποκρίνεται στον ενδοκυττάριο λιποπολυσακχαρίτη.

Η ενεργοποίηση απαιτεί δύο σήματα. Το πρώτο σήμα είναι η προετοιμασία: ένας προσδέτης υποδοχέα τύπου Toll επάγει την εξαρτώμενη από το NF-kB μεταγραφή των NLRP3 και pro-IL-1beta, ώστε να υπάρχουν τα συστατικά. Το δεύτερο σήμα είναι η συναρμολόγηση: ένα δεύτερο ερέθισμα προκαλεί τον ολιγομερισμό της ASC σε συσσωματώματα, τη διάσπαση της κασπάσης-1 στο θραύσμα p20 και την απελευθέρωση της ώριμης IL-1beta p17. Οι μιτοχονδριακές δραστικές μορφές οξυγόνου και η πρόσληψη κρυστάλλων είναι γνωστοί παράγοντες που συμβάλλουν στο δεύτερο σήμα για το NLRP3.

Η μελέτη του 2017 σε μακροφάγα για την ευρεία αναστολή των φλεγμονοσωμάτων εξέτασε το κυανό του μεθυλενίου και στα δύο σήματα. Σε μακροφάγα μυελού των οστών ποντικών που είχαν προετοιμαστεί με λιποπολυσακχαρίτη, η νιγερικίνη, το ATP και οι κρύσταλλοι ουρικού μονονατρίου προκάλεσαν, το καθένα, απελευθέρωση IL-1beta και κασπάσης-1, καθώς και σχηματισμό συσσωματωμάτων ASC. Το κυανό του μεθυλενίου σε συγκεντρώσεις 20 έως 200 micromolar μείωσε και τα τρία με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, χωρίς να θανατώνει τα κύτταρα. Η φλαγγελλίνη και η Salmonella για το NLRC4, το δίκλωνο DNA και η Listeria για το AIM2, καθώς και ο λιποπολυσακχαρίτης που εισήχθη με διαμόλυνση ή ζωντανά E. coli για τη μη κανονική οδό έδειξαν το ίδιο μοτίβο. Η ένωση από μόνη της δεν προκάλεσε απελευθέρωση και οι πλάκες ελέγχου δεν έδειξαν αντιβακτηριακή δράση, επομένως το αποτέλεσμα αφορά την απόκριση του ξενιστή.

Σε προηγούμενα στάδια της οδού μετρήθηκαν τρεις παρεμβάσεις. Το μιτοχονδριακό υπεροξείδιο που προκαλούσε η ροτενόνη μειώθηκε με το κυανό του μεθυλενίου, όπως και η απελευθέρωση IL-1beta που προκαλούσε η ροτενόνη. Η πρόσληψη φθοριζόντων σφαιριδίων μειώθηκε, εύρημα συμβατό με μειωμένη φαγοκυττάρωση πριν από την ανίχνευση των κρυστάλλων. Ένας αναφορέας υπό τον έλεγχο του υποκινητή του NLRP3, ο οποίος περιείχε δύο θέσεις NF-kB, έδειξε χαμηλότερη δραστηριότητα με το κυανό του μεθυλενίου, ενώ ένας συντετμημένος υποκινητής χωρίς αυτές τις θέσεις δεν ανταποκρίθηκε. Σε δοκιμαστικό σωλήνα χωρίς κύτταρα, το κυανό του μεθυλενίου μείωσε επίσης άμεσα τη δραστηριότητα ανασυνδυασμένης ανθρώπινης κασπάσης-1. Η προσθήκη της ένωσης μόνο κατά την προετοιμασία ή μόνο κατά την ενεργοποίηση εξακολουθούσε να μειώνει την απελευθέρωση IL-1beta, IL-18 και κασπάσης-1, επομένως εμπλέκονται και τα δύο στάδια.

Οι δοκιμές σε ποντίκια συμφωνούσαν με αυτή την επιλεκτικότητα. Μια θανατηφόρα δόση λιποπολυσακχαρίτη θανάτωσε τα ζώα ελέγχου μέσα σε λίγες ώρες, ενώ το κυανό του μεθυλενίου βελτίωσε την επιβίωση· η περιτοναϊκή IL-1beta μειώθηκε, αλλά η IL-6 στο ίδιο υγρό δεν μειώθηκε. Σε μοντέλο περιτονίτιδας από Listeria, η περιτοναϊκή IL-1beta μειώθηκε, ενώ ο συνολικός αριθμός κυττάρων παρέμεινε αμετάβλητος. Τα ανθρώπινα μονοκύτταρα THP-1 συμπεριφέρθηκαν όπως τα μακροφάγα ποντικών και στους τέσσερις τύπους φλεγμονοσωμάτων. Ένα αποτέλεσμα που αφορά το φλεγμονόσωμα εξηγεί την ωρίμανση των IL-1beta και IL-18, όχι κάθε κυτταροκίνης. Γι’ αυτό και η μορφολογία των ανοσοκυττάρων του εγκεφάλου στα πειράματα με μικρογλοία και αστροκύτταρα απαντά σε διαφορετικό ερώτημα από τη συναρμολόγηση του ικριώματος.

Οδός 2: μεταγραφή του iNOS μέσω της πρόσδεσης NF-kB και STAT1

Η επαγώγιμη συνθάση του μονοξειδίου του αζώτου, ή iNOS, είναι ελάχιστα παρούσα σε κατάσταση ηρεμίας και η μεταγραφή της επάγεται όταν χρειάζεται. Ο λιποπολυσακχαρίτης την επάγει κυρίως μέσω της αποδόμησης του IkB-alpha, την οποία ακολουθούν η φωσφορυλίωση του NF-kB και η είσοδός του στον πυρήνα. Η ιντερφερόνη-γάμμα την επάγει κυρίως μέσω της φωσφορυλίωσης του STAT1 από κινάση Janus, την οποία ακολουθεί η είσοδος του STAT1 στον πυρήνα. Στη συνέχεια, κάθε παράγοντας προσδένεται στη δική του θέση στον υποκινητή του iNOS. Η ενζυμική δραστηριότητα και η επαγωγή του γονιδίου είναι ξεχωριστά σημεία ελέγχου και ένα φάρμακο μπορεί να δρα στο ένα ή και στα δύο.

Η μελέτη του 2015 για την επαγωγή του iNOS σε μακροφάγα και ποντίκια με ενδοτοξιναιμία εντόπισε την επίδραση στο επίπεδο του αγγελιοφόρου RNA. Σε κύτταρα RAW 264.7 και πρωτογενή μακροφάγα ποντικών, κυανό του μεθυλενίου σε συγκέντρωση 1 micromolar, χορηγούμενο 30 λεπτά πριν από λιποπολυσακχαρίτη, ιντερφερόνη-γάμμα ή και τα δύο, μείωσε την πρωτεΐνη και το mRNA του iNOS στο διάστημα 8 έως 24 ωρών, με λιγότερα νιτρώδη στο καλλιεργητικό μέσο και χωρίς μείωση της βιωσιμότητας. Σε ποντίκια που έλαβαν 25 mg ανά kg λιποπολυσακχαρίτη, μία δόση 5 mg ανά kg μία ώρα νωρίτερα μείωσε την πρωτεΐνη και το mRNA του iNOS στους πνεύμονες, στο ήπαρ και στην καρδιά.

Η χαρακτηριστική λεπτομέρεια είναι τι δεν άλλαξε. Η αποδόμηση του IkB-alpha, η φωσφορυλίωση του NF-kB, η φωσφορυλίωση του STAT1 και η συσσώρευση καθενός από τους δύο παράγοντες στον πυρήνα παρέμειναν ανεπηρέαστες. Η διακοπή εμφανίστηκε ένα στάδιο αργότερα: τα πυρηνικά εκχυλίσματα έδειξαν μικρότερη πρόσδεση του NF-kB στο αντίστοιχο στοιχείο DNA μετά τον λιποπολυσακχαρίτη και μικρότερη πρόσδεση του STAT1 μετά την ιντερφερόνη-γάμμα. Η ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης επιβεβαίωσε μικρότερη παρουσία καθενός από τους δύο παράγοντες στον υποκινητή του iNOS μέσα στα κύτταρα. Ο παράγοντας νέκρωσης όγκων άλφα, του οποίου ο υποκινητής χρησιμοποιεί επίσης το NF-kB, μειώθηκε επίσης. Οι παράγοντες ενεργοποιήθηκαν και έφτασαν στον πυρήνα, αλλά προσδέθηκαν ανεπαρκώς στο DNA-στόχο τους.

Προσέξτε τη διαφορά από την οδό 1. Εδώ εξετάζεται η πρόσδεση παραγόντων στο DNA, χρησιμοποιείται το STAT1 αντί του STAT3 και μετρώνται mRNA, πρωτεΐνη και νιτρώδη αντί για συσσωματώματα ASC και θραύσματα κασπάσης-1. Ο χάρτης μας των στόχων του κυανού του μεθυλενίου σε κυτταρικά μοντέλα διατηρεί αυτό το μεταγραφικό επίπεδο ξεχωριστό από τις άμεσες ενζυμικές και μιτοχονδριακές μετρήσεις.

Οδός 3: IL-6 ορού και ενεργοποίηση STAT3 στους ιστούς

Η IL-6 σηματοδοτεί μέσω της οικογένειας υποδοχέων gp130 προς τον καταρράκτη από τις κινάσες Janus στο STAT3. Το φωσφορυλιωμένο STAT3 σχηματίζει διμερή, εισέρχεται στον πυρήνα και ενεργοποιεί φλεγμονώδη προγράμματα, ενώ η ίδια η IL-6 είναι στόχος του NF-kB. Έτσι, τα δύο σχηματίζουν έναν βρόχο ανατροφοδότησης που συχνά ονομάζεται άξονας IL-6 προς STAT3. Οι συνήθεις μετρούμενοι δείκτες είναι η IL-6 ορού σε προηγούμενο στάδιο, ο λόγος φωσφορυλιωμένου προς συνολικό STAT3 και εκτελεστικά ένζυμα όπως τα iNOS και COX2 σε επόμενα στάδια.

Η μελέτη του 2023 σε ποντίκια για την IL-6 και το STAT3 μετά από λιποπολυσακχαρίτη μέτρησε τον άξονα σε διαφορετικά διαμερίσματα του οργανισμού. Αρσενικά ποντίκια C57BL/6 έλαβαν 1 mg ανά kg λιποπολυσακχαρίτη καθημερινά για τρεις ημέρες, με 5 ή 10 mg ανά kg κυανού του μεθυλενίου 30 λεπτά μετά από κάθε δόση. Την τρίτη ημέρα, η IL-6 ορού ήταν χαμηλότερη και στις δύο ομάδες κυανού του μεθυλενίου σε σύγκριση με την ομάδα που έλαβε μόνο λιποπολυσακχαρίτη, ενώ οι περισσότερες άλλες κυτταροκίνες της εξεταζόμενης ομάδας δεν μεταβλήθηκαν με τη χορήγηση. Οι λόγοι φωσφορυλιωμένου προς συνολικό STAT3 ήταν χαμηλότεροι στον φλοιό, στον ιππόκαμπο και στο δέρμα του αυτιού, με μειωμένη χρώση της μικρογλοίας για Iba-1, χαμηλότερα iNOS και COX2 και εν μέρει περιορισμένη απώλεια βάρους.

Εδώ χρειάζονται δύο επισημάνσεις. Η χαμηλότερη IL-6 ορού μαζί με τη χαμηλότερη φωσφορυλίωση του STAT3 στους ιστούς είναι συμβατές με τροποποίηση του άξονα, αλλά δεν απομονώνουν τον κύριο κόμβο επίδρασης: λιγότερη κυτταροκίνη σε προηγούμενο στάδιο, ασθενέστερη σηματοδότηση του υποδοχέα ή μεταβολή της δραστηριότητας φωσφατασών θα μπορούσαν να παράγουν τον ίδιο λόγο. Επίσης, το βάρος κατά τη διάρκεια τριών ημερών οξείας πρόκλησης είναι δείκτης που αφορά ολόκληρο το ζώο, όχι βαθμολογία συμπτωμάτων ή ύφεσης. Προσθέτει πληροφορίες πέρα από μια ανάλυση ανοσοαποτύπωσης, χωρίς να μετατρέπει ένα αποτέλεσμα σηματοδότησης σε ισχυρισμό θεραπείας. Η ξεχωριστή χημεία της μιτοχονδριακής οξειδοαναγωγικής ρύθμισης εξελίσσεται παράλληλα με αυτή την περιγραφή των κυτταροκινών και δεν πρέπει να συγχωνεύεται μαζί της.

Σύγκριση οδών: σημεία παρέμβασης και μετρούμενοι δείκτες

Ο πίνακας αποκλείει τρεις αβάσιμες μεταφορές συμπερασμάτων. Ένα αποτέλεσμα για τα συσσωματώματα ASC δεν αποδεικνύει αποτέλεσμα για το STAT3. Ένα αποτέλεσμα για την πρόσδεση του STAT1 στον υποκινητή του iNOS δεν αποδεικνύει αποτέλεσμα για το STAT3, παρότι και οι δύο πρωτεΐνες ανήκουν στην οικογένεια STAT. Ένα αποτέλεσμα για την IL-6 ορού δεν αποδεικνύει μειωμένη συναρμολόγηση φλεγμονοσωμάτων: στο περιτοναϊκό πείραμα η IL-1beta μειώθηκε, ενώ η IL-6 όχι. Κάθε σειρά χρειάζεται το δικό της ερέθισμα και τον δικό της μετρούμενο δείκτη. Γι’ αυτό, η ανάγνωση κυτταρικών, ζωικών και κλινικών μελετών για το κυανό του μεθυλενίου απαιτεί να αντιστοιχίζεται κάθε ισχυρισμός στο επίπεδο που μετρήθηκε.

Τίποτα από αυτά δεν τεκμηριώνει δοσολογία, ασφάλεια ή όφελος στους ανθρώπους. Τα μοντέλα λιποπολυσακχαρίτη είναι ελεγχόμενα ερεθίσματα για τη δοκιμή ενός μηχανισμού, όχι αντίγραφα χρόνιας νόσου. Η χορήγηση παράλληλα με το ερέθισμα εξετάζει την πρόληψη μιας προκαλούμενης μεταβολής, όχι την αναστροφή μιας ήδη εγκατεστημένης νόσου. Διατηρήστε αυτή την περιγραφή μηχανισμών ξεχωριστή από τις εκβάσεις ασθενών και αξιολογήστε κάθε ισχυρισμό υγείας με βάση τη μελέτη σε ασθενείς που τον στηρίζει.