Το κυανό του μεθυλενίου στις εργαστηριακές εξετάσεις G6PD: ποιος είναι πραγματικά ο ρόλος της χρωστικής

Ένας φοιτητής παρατηρεί δύο σωληνάρια μετά την επώαση. Το ένα έχει αποκτήσει το αναμενόμενο χρώμα. Το άλλο όχι. Ο φοιτητής συμπεραίνει ότι ο δεύτερος ασθενής έχει ανεπάρκεια αφυδρογονάσης της 6-φωσφορικής γλυκόζης. Το συμπέρασμα μπορεί να είναι σωστό, αλλά ο συλλογισμός παρακάμπτει την έννοια στην οποία βασίζεται η λειτουργία της δοκιμασίας. Τίποτα μέσα στο σωληνάριο δεν μετρά άμεσα το ένζυμο. Το σωληνάριο μετρά αυτό που παράγει το ένζυμο, χρησιμοποιώντας το κυανό του μεθυλενίου ως ενδιάμεσο.

Μόλις γίνει σαφής αυτή η έμμεση μέτρηση, η διαδικασία, οι μάρτυρες και ο μακρύς κατάλογος των ψευδών αποτελεσμάτων παύουν να φαίνονται αυθαίρετα.

Η σύντομη απάντηση

Το κυανό του μεθυλενίου στις εξετάσεις G6PD είναι οξειδοαναγωγικός δείκτης. Το ένζυμο G6PD παράγει NADPH και τα συστήματα που εξαρτώνται από το NADPH ανάγουν το μπλε κυανό του μεθυλενίου στην άχρωμη λευκομορφή του ή το χρησιμοποιούν για τη μεταφορά ηλεκτρονίων. Η φυσιολογική ενζυμική δραστικότητα επιτρέπει αποτελεσματική αναγωγή. Η ανεπαρκής δραστικότητα οδηγεί σε αργή ή ατελή αναγωγή. Αυτό είναι ολόκληρο το σήμα της δοκιμασίας.

Δύο ιστορικές μέθοδοι χρησιμοποιούν την ίδια χρωστική, αλλά διαφέρουν ως προς το τελικό σημείο αξιολόγησης. Αν τις διακρίνετε, η περισσότερη σύγχυση εξαφανίζεται.

Δύο δοκιμασίες, μία χρωστική, διαφορετικά τελικά σημεία

Η πρώτη είναι η δοκιμασία άμεσης αναγωγής του κυανού του μεθυλενίου, που περιγράφηκε από τον Sass και τους συνεργάτες του και αργότερα αξιολογήθηκε από τον Gibbs. Εδώ το τελικό σημείο είναι η ίδια η χρωστική: το οξειδωμένο, μπλε κυανό του μεθυλενίου ανάγεται προς το άχρωμο λευκοκυανό του μεθυλενίου και ο ρυθμός αυτής της μεταβολής αντανακλά την ικανότητα παραγωγής NADPH. Η αρχική δημοσίευση για τη δοκιμασία αρχικού ελέγχου είναι καταχωρισμένη στο PubMed ως Sass και συν. (1966).

Η δεύτερη είναι η δοκιμασία αναγωγής της μεθαιμοσφαιρίνης κατά Brewer. Το νιτρώδες νάτριο οξειδώνει πρώτα την αιμοσφαιρίνη σε καστανή μεθαιμοσφαιρίνη. Στη συνέχεια, το κυανό του μεθυλενίου δρα ως μεσολαβητής μεταφοράς ηλεκτρονίων: το ανηγμένο κυανό του μεθυλενίου μεταφέρει αναγωγικά ισοδύναμα στη μεθαιμοσφαιρίνη, μετατρέποντάς τη ξανά σε ερυθρή αιμοσφαιρίνη. Επομένως, το ορατό τελικό σημείο είναι καστανό έναντι ερυθρού, όχι μπλε έναντι άχρωμου. Η αρχική μέθοδος δημοσιεύτηκε στο Δελτίο του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (Brewer και συν., 1960).

Ο χαρακτηρισμός της δοκιμασίας Brewer ως δοκιμασίας αποχρωματισμού της χρωστικής είναι χημικά ανακριβής. Η χρωστική συμμετέχει σε έναν κύκλο οξειδοαναγωγής· η αιμοσφαιρίνη είναι εκείνη που αλλάζει χρώμα. Το παρακάτω διάγραμμα παρουσιάζει και τις δύο οδούς.

Η αντίδραση στην οποία βασίζεται η δοκιμασία

Η G6PD καταλύει το πρώτο οξειδωτικό βήμα της οδού των φωσφορικών πεντοζών:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

Τα ώριμα ερυθροκύτταρα εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από αυτή την οδό για την παραγωγή NADPH, όπως αναλύεται στην ανασκόπηση των Luzzatto και συνεργατών στο Blood (2020). Το NADPH διατηρεί τη γλουταθειόνη σε ανηγμένη μορφή και προστατεύει το κύτταρο από οξειδωτική βλάβη. Το κυανό του μεθυλενίου εντάσσεται σε αυτό το σύστημα ως δέκτης ηλεκτρονίων. Η επαρκής G6PD εξασφαλίζει επαρκές NADPH, το οποίο επιτρέπει αποτελεσματική αναγωγή. Η χαμηλή G6PD διακόπτει την αλυσίδα στον πρώτο της κρίκο.

Σκεφτείτε τη χρωστική ως δείκτη καυσίμου, όχι ως κινητήρα. Δείχνει τη διαθεσιμότητα NADPH. Οτιδήποτε άλλο μεταβάλλει αυτή τη διαθεσιμότητα ή την ένδειξη μπορεί να μετακινήσει τη βελόνα χωρίς καμία αλλαγή στο γονίδιο.

Πώς εκτελείται η διαδικασία τύπου Brewer

Οι συνθέσεις των αντιδραστηρίων έχουν μεταβληθεί με την πάροδο των δεκαετιών, επομένως μια εκπαιδευτική περιγραφή δεν πρέπει να εκλαμβάνεται ως κλινικό πρωτόκολλο. Κάθε εργαστήριο ακολουθεί τη δική του επικυρωμένη τυποποιημένη διαδικασία λειτουργίας. Με αυτή την επιφύλαξη, η κλασική διάταξη σωληναρίων λειτουργεί ως εξής, σε μια εκδοχή που περιγράφεται με τρία σωληνάρια και επώαση 3 ωρών σε αυτή τη δημοσιευμένη εφαρμογή:

1. Σωληνάριο ασθενούς: ολικό αίμα μαζί με γλυκόζη, νιτρώδες νάτριο και κυανό του μεθυλενίου. Το νιτρώδες σχηματίζει μεθαιμοσφαιρίνη, η γλυκόζη τροφοδοτεί τον μεταβολισμό των ερυθροκυττάρων και η χρωστική εξασφαλίζει τη μεταφορά ηλεκτρονίων που εξαρτάται από το NADPH.
2. Οξειδωμένος μάρτυρας: αίμα μαζί με νιτρώδες και γλυκόζη, αλλά χωρίς κυανό του μεθυλενίου. Δείχνει το καστανό τελικό σημείο της μεθαιμοσφαιρίνης, δηλαδή την εικόνα ανεπάρκειας.
3. Μάρτυρας αιμοσφαιρίνης: αίμα μαζί με νερό. Δείχνει το ερυθρό τελικό σημείο της αιμοσφαιρίνης, δηλαδή τη φυσιολογική εικόνα.
4. Επωάστε όλα τα σωληνάρια κοντά στους 37 C, συνήθως για 3 ώρες, αναμειγνύοντας απαλά.
5. Αραιώστε ένα μικρό κλάσμα από κάθε σωληνάριο σε απεσταγμένο νερό, ώστε να προκληθεί λύση των κυττάρων και να γίνει ευδιάκριτη η σύγκριση των χρωμάτων.
6. Συγκρίνετε το σωληνάριο του ασθενούς με τους δύο μάρτυρες. Η επαναφορά προς το ερυθρό υποδηλώνει σημαντική αναγωγική ικανότητα. Η παραμονή προς το καστανό υποδηλώνει έντονη ανεπάρκεια.

Μια ιστορική σύνθεση χρησιμοποιούσε περίπου 1 mL αίματος με αντιδραστήρια σε συγκεντρώσεις κοντά στα 180 mM νιτρώδους νατρίου, 280 mM δεξτρόζης και 0.4 mM κυανού του μεθυλενίου. Αντιμετωπίστε αυτές τις τιμές ως παράδειγμα από τη βιβλιογραφία, όχι ως καθολική προδιαγραφή.

Ανάγνωση του αποτελέσματος

Μια ποιοτική δοκιμασία αρχικού ελέγχου διακρίνει καλύτερα τις περιπτώσεις γύρω στο 30 έως 40 τοις εκατό της φυσιολογικής δραστικότητας, όπως αναλύεται σε αυτή την ανασκόπηση του Malaria Journal για τα κενά στην ανίχνευση της ανεπάρκειας G6PD. Επομένως, ένα φυσιολογικό αποτέλεσμα αρχικού ελέγχου σημαίνει ότι η δοκιμασία δεν ανίχνευσε σοβαρή ανεπάρκεια. Δεν πιστοποιεί πλήρως φυσιολογική δραστικότητα.

Γιατί ο αρχικός έλεγχος μπορεί να παραπλανήσει

Η δικτυοερυθροκυττάρωση μετά από αιμόλυση είναι η κλασική αιτία ψευδώς φυσιολογικού αποτελέσματος. Τα νεαρά ερυθροκύτταρα και τα δικτυοερυθροκύτταρα περιέχουν περισσότερη G6PD από τα παλαιότερα κύτταρα. Κατά τη διάρκεια ενός οξέος αιμολυτικού επεισοδίου, τα παλαιότερα κύτταρα με τη μεγαλύτερη ανεπάρκεια μπορεί να έχουν ήδη καταστραφεί, αφήνοντας έναν νεαρό πληθυσμό του οποίου η δραστικότητα εμφανίζεται φυσιολογική στην εξέταση. Ο ίδιος βιολογικός μηχανισμός παραπλανά και τις ποσοτικές δοκιμασίες, όχι μόνο τους ελέγχους με χρωστική.

Η πρόσφατη μετάγγιση συγκαλύπτει την ανεπάρκεια, επειδή τα ερυθροκύτταρα του δότη συνεισφέρουν το δικό τους ένζυμο στο δείγμα. Τα Mayo Clinic Laboratories περιλαμβάνουν τη μετάγγιση στις αιτίες μη αξιόπιστων ενζυμικών αποτελεσμάτων, μαζί με τη δικτυοερυθροκυττάρωση και την παρεμβολή των λευκοκυττάρων.

Οι ετερόζυγες γυναίκες αποτελούν τη δυσκολότερη περίπτωση. Η τυχαία αδρανοποίηση του χρωμοσώματος Χ παράγει ένα μείγμα φυσιολογικών ερυθροκυττάρων και ερυθροκυττάρων με ανεπάρκεια, ενώ η συνολική δραστικότητα μπορεί να κυμαίνεται από σοβαρά ανεπαρκή έως φαινομενικά φυσιολογική. Οι ποιοτικές δοκιμασίες αρχικού ελέγχου συχνά δεν ανιχνεύουν τους ενδιάμεσους φαινοτύπους. Η τεκμηρίωση του ΠΟΥ για τις εξετάσεις G6PD αναλύει λεπτομερώς αυτόν τον περιορισμό.

Ο χρόνος που έχει παρέλθει από τη λήψη του δείγματος, η θερμοκρασία αποθήκευσης, η υποκειμενικότητα της οπτικής αξιολόγησης του τελικού σημείου, ο αιματοκρίτης και η ποιότητα των αντιδραστηρίων προσθέτουν αναλυτικό θόρυβο σε αυτές τις βιολογικές επιδράσεις.

Ο αρχικός έλεγχος δεν είναι διάγνωση

Ένα αποτέλεσμα αρχικού ελέγχου που υποδηλώνει ανεπάρκεια, είναι ενδιάμεσο ή δεν συμφωνεί με την κλινική εικόνα απαιτεί ποσοτική μέτρηση της ενζυμικής δραστικότητας G6PD. Ο ΠΟΥ θεωρεί την ποσοτική φασματοφωτομετρία με ελεγχόμενη θερμοκρασία ως μέθοδο αναφοράς. Σε αυτή τη δοκιμασία, προστίθενται 6-φωσφορική γλυκόζη και NADP+ σε αιμόλυμα ερυθροκυττάρων και το NADPH που σχηματίζεται παρακολουθείται μέσω της αυξανόμενης απορρόφησης στα 340 nm. Ο ρυθμός μεταβολής είναι ανάλογος της ενζυμικής δραστικότητας, η οποία συνήθως εκφράζεται σε μονάδες ανά γραμμάριο αιμοσφαιρίνης. Η τρέχουσα πρακτική των κλινικών εργαστηρίων συνοψίζεται στην καταχώριση του καταλόγου εξετάσεων Mayo για τη δραστικότητα G6PD.

Η ερμηνεία χρησιμοποιεί το επικυρωμένο εύρος αναφοράς του εργαστηρίου, συχνά σε σχέση με τη φυσιολογική δραστικότητα του πληθυσμού, με την ανεπάρκεια να συζητείται συνήθως κοντά στο όριο του 30 τοις εκατό και την ενδιάμεση δραστικότητα πάνω από αυτό. Τα προφίλ στόχων προϊόντων του ΠΟΥ για τις εξετάσεις G6PD (2022) καθορίζουν αυτό το διαγνωστικό πλαίσιο. Αν πρόσφατη αιμόλυση ή μετάγγιση καθιστά αναξιόπιστο τον προσδιορισμό του φαινοτύπου, επαναλάβετε την εξέταση αφού ο πληθυσμός των ερυθροκυττάρων επανέλθει σε ισορροπία· ο μοριακός έλεγχος μπορεί να προσθέσει πληροφορίες χωρίς να αντικαθιστά τη μέτρηση του ενζύμου.

Μια διάκριση που αξίζει να διατηρηθεί

Το κυανό του μεθυλενίου σε αυτές τις δοκιμασίες είναι εργαστηριακό αντιδραστήριο ex vivo. Αυτό ανήκει σε διαφορετική συζήτηση από την ασφάλεια της χορήγησης κυανού του μεθυλενίου σε ασθενή, η οποία καλύπτεται στις οδηγίες για τις αντενδείξεις του κυανού του μεθυλενίου. Η βιοχημεία συνδέει τις δύο χρήσεις, καθώς και το φάρμακο εξαρτάται από αναγωγή που βασίζεται στο NADPH, αλλά μια χρωστική μέσα σε δοκιμαστικό σωλήνα δεν είναι μια δόση μέσα στην κυκλοφορία του αίματος. Για το πώς συμπεριφέρεται η χρωστική κατά τη χρώση σε διαφορετικό πλαίσιο, δείτε τις αρχές χρώσης με κυανό του μεθυλενίου, και για τη χημική οικογένεια στην οποία ανήκει, τις οξειδοαναγωγικές χρωστικές στο εργαστήριο.

Ο αρχικός έλεγχος εξετάζει αν η αναγωγική ικανότητα φαίνεται ακέραιη. Η επιβεβαιωτική εξέταση εξετάζει πόσο ένζυμο υπάρχει πραγματικά. Η χρωστική εξυπηρετεί καλά το πρώτο ερώτημα, αρκεί κανείς να μην της ζητά να απαντήσει στο δεύτερο.