Κυανό του μεθυλενίου και ALS: γιατί τα αποτελέσματα διαφέρουν μεταξύ πειραματικών μοντέλων

Αν αναζητήσετε πληροφορίες για το κυανό του μεθυλενίου και την ALS, θα βρείτε δύο ισχυρισμούς που φαίνεται να αντιφάσκουν μεταξύ τους. Ο ένας λέει ότι η μπλε χρωστική προστάτευσε νευρώνες σε μοντέλα ALS. Ο άλλος λέει ότι δεν είχε κανένα αποτέλεσμα σε ποντικό με ALS. Και οι δύο ισχυρισμοί παραπέμπουν σε πραγματικές δημοσιεύσεις, και αξίζει να ληφθούν σοβαρά υπόψη και οι δύο δημοσιεύσεις. Η αντίφαση διαλύεται μόλις διατυπωθεί η βασική αρχή πίσω από κάθε πείραμα: το μοντέλο καθορίζει τον ισχυρισμό.

Ένα αποτέλεσμα σε σκώληκα αποτελεί ισχυρισμό για έναν σκώληκα. Ένα αποτέλεσμα σε προνύμφη ψαριού αποτελεί ισχυρισμό για μια προνύμφη ψαριού. Κανένα από τα δύο δεν αποτελεί ισχυρισμό για έναν ασθενή, μέχρι να τον υποστηρίξει η πορεία της νόσου σε θηλαστικό. Αυτό το άρθρο συγκρίνει παράλληλα τις δύο δημοσιεύσεις που αναφέρονται συχνότερα, ώστε να δείτε γιατί διαφέρουν οι απαντήσεις τους.

Τα δύο πειράματα σε έναν πίνακα

Κρατήστε αυτόν τον πίνακα ανοιχτό όσο διαβάζετε. Περιλαμβάνει κάθε σημαντική διαφορά μεταξύ των μελετών.

Διαφέρουν τα γενετικά χαρακτηριστικά, τα είδη, η οδός χορήγησης, ο χρόνος έναρξης και τα καταληκτικά σημεία. Ο γονότυπος είναι μόνο μία από τις πέντε διαφορές, οπότε οι δύο μελέτες δεν μπορούν να αποδείξουν ότι το κυανό του μεθυλενίου δρα επιλεκτικά σε μία οδό της ALS. Αποδεικνύουν κάτι πιο περιορισμένο, αλλά και πάλι χρήσιμο: η έντονη αποκατάσταση με πρώιμη άμεση έκθεση σε απλά μοντέλα δεν μεταφέρθηκε στην πορεία της νόσου σε θηλαστικό με χρόνια χορήγηση από το στόμα.

Το θετικό αποτέλεσμα: τι έδειξε η μελέτη σε σκώληκες και ψάρια

Η μελέτη του 2012 σε σκώληκες και ψάρια εξέφρασε μεταλλαγμένη ανθρώπινη TDP-43 ή FUS στους κινητικούς νευρώνες σκωλήκων και εισήγαγε με ένεση μεταλλαγμένο ανθρώπινο mRNA σε έμβρυα ψαριών. Πρόκειται για μοντέλα πρωτεοτοξικότητας. Αναπαράγουν τις τοξικές επιδράσεις της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης στην κίνηση και στη μορφολογία των νευρώνων μέσα σε ημέρες, όχι την πλήρη πορεία της ALS σε ενήλικους ανθρώπους επί χρόνια.

Η αγωγή ξεκίνησε πολύ νωρίς. Οι σκώληκες αναπτύχθηκαν σε άγαρ που περιείχε κυανό του μεθυλενίου από την εκκόλαψη. Τα έμβρυα ψαριών παρέμειναν σε διάλυμα του φαρμάκου κατά τη διάρκεια της νύχτας, με έναρξη 24 ώρες μετά τη γονιμοποίηση, και η συμπεριφορά τους ελέγχθηκε περίπου δύο ημέρες αργότερα. Δεν μεσολαβούσε αιματοεγκεφαλικός φραγμός μεταξύ φαρμάκου και νευρώνα όπως συμβαίνει σε ένα θηλαστικό, και δεν μετρήθηκαν επίπεδα του φαρμάκου στο πλάσμα ή στον εγκέφαλο.

Υπό αυτές τις συνθήκες, οι επιδράσεις ήταν μεγάλες και συνεπείς. Τόσο τα 6 όσο και τα 60 μM μείωσαν την παράλυση που σχετίζεται με την ηλικία στους σκώληκες με TDP-43 και FUS. Τη 12η ημέρα της ενήλικης ζωής, περίπου το 80 τοις εκατό των σκωλήκων με TDP-43 που δεν είχαν λάβει αγωγή ήταν παράλυτοι, έναντι περίπου 10 τοις εκατό των σκωλήκων που είχαν λάβει αγωγή από την εκκόλαψη. Μια δοκιμασία συναπτικής λειτουργίας έδειξε την ίδια κατεύθυνση: οι σκώληκες με TDP-43 ήταν υπερευαίσθητοι στο aldicarb, ένα φάρμακο που χρησιμοποιείται για τη διερεύνηση της νευρομυϊκής μετάδοσης, και το κυανό του μεθυλενίου μετατόπισε την απόκριση προς το φυσιολογικό. Ο αριθμός των εκφυλιζόμενων αποφυάδων κινητικών νευρώνων μειώθηκε, με τη σαφέστερη επίδραση στα 60 μM. Στα ψάρια, η κολύμβηση που προκαλούνταν από άγγιγμα βελτιώθηκε σημαντικά και οι βραχύτεροι κινητικοί άξονες αναπτύχθηκαν ξανά προς το φυσιολογικό μήκος στα 30 ή 60 μM, αν και η αποκατάσταση ήταν μερική και όχι πλήρης.

Τα δεδομένα για το οξειδωτικό στρες συνάδουν με μια αντιοξειδωτική ερμηνεία. Οι μεταλλαγμένοι σκώληκες και τα ψάρια εμφάνισαν αυξημένους δείκτες δραστικών μορφών οξυγόνου, οι οποίοι μειώθηκαν με την αγωγή, ενώ οι φυσιολογικοί σκώληκες που λάμβαναν κυανό του μεθυλενίου επιβίωσαν πολύ περισσότερο από τους σκώληκες χωρίς αγωγή όταν εκτέθηκαν σε προοξειδωτικό παράγοντα. Ωστόσο, δύο περιορισμοί έχουν σημασία. Τα συνολικά επίπεδα των μεταλλαγμένων πρωτεϊνών TDP-43 και FUS δεν μειώθηκαν, και η μελέτη δεν ποσοτικοποίησε άμεσα τα πρωτεϊνικά συσσωματώματα, επομένως δείχνει λειτουργική αποκατάσταση χωρίς να αποδεικνύει απομάκρυνση των συσσωματωμάτων. Όποιος παρακολουθεί πώς διατυπώνονται συνήθως οι υποθέσεις για την οξειδοαναγωγή και τα μιτοχόνδρια θα πρέπει να θεωρεί ότι ο μηχανισμός υποστηρίζεται από ενδείξεις, αλλά δεν έχει τεκμηριωθεί οριστικά.

Ο χρόνος έναρξης ήταν η πιο διδακτική λεπτομέρεια. Όταν οι συγγραφείς περίμεναν μέχρι την 5η ημέρα της ενήλικης ζωής για να ξεκινήσουν την αγωγή, το ποσοστό παράλυσης τη 12η ημέρα ήταν περίπου 55 τοις εκατό, αντί για περίπου 10 τοις εκατό με αγωγή από την εκκόλαψη. Ίδιο φάρμακο, ίδιος σκώληκας, ίδια μετάλλαξη, πολύ μικρότερη επίδραση. Μεγάλο μέρος του φαινομενικού οφέλους συνδεόταν με την πρώιμη προφυλακτική έκθεση.

Το μηδενικό αποτέλεσμα: τι έδειξε η μελέτη σε ποντικούς με SOD1

Η μελέτη του 2011 σε ποντικούς έθεσε ένα δυσκολότερο ερώτημα σε ένα αυστηρότερο σύστημα. Οι συγγενικοί ποντικοί με SOD1 G93A εξελίσσονται από τρόμο των οπίσθιων άκρων σε διαταραχή της βάδισης και απώλεια του αντανακλαστικού επαναφοράς στην όρθια θέση, έως ένα προκαθορισμένο τελικό καταληκτικό σημείο. Η αγωγή ξεκίνησε πριν από τα συμπτώματα, την ημέρα 45, και συνεχίστηκε καθημερινά, με τους παρατηρητές να βαθμολογούν τη νευρολογική κατάσταση σε κλίμακα από 0 έως 6. Πρόκειται για πείραμα που καλύπτει ολόκληρη την πορεία της νόσου, γεγονός που το φέρνει πιο κοντά σε όσα θα ενδιέφεραν έναν ασθενή από οποιαδήποτε καμπύλη παράλυσης σε σκώληκα.

Τα κύρια αποτελέσματα ήταν μηδενικά. Η συνολική έναρξη εμφανίστηκε στις 121 ημέρες στην ομάδα ελέγχου, έναντι 124 ημερών με κυανό του μεθυλενίου, διαφορά που δεν ήταν σημαντική. Η επιβίωση έως το τελικό στάδιο ήταν 167 ημέρες έναντι 170 ημερών, επίσης χωρίς σημαντική διαφορά. Μερικές δευτερεύουσες αναλύσεις ευνόησαν την αγωγή: τα θηλυκά εμφάνισαν καθυστέρηση στην έναρξη κατά περίπου 7 ημέρες, και τα ζώα που έλαβαν αγωγή πέρασαν κάπως περισσότερο χρόνο σε ηπιότερα στάδια και λιγότερο σε σοβαρά. Με μικρές υποομάδες ανά φύλο και πολλές συγκρίσεις σταδίων, αυτές οι αναλύσεις προσφέρονται για διατύπωση υποθέσεων και όχι ως απόδειξη. Δεν μετρήθηκαν αριθμοί νευρώνων, δεν έγινε δοκιμασία συσσωμάτωσης της SOD1 και δεν μετρήθηκαν δείκτες οξείδωσης ή φλεγμονής, επομένως η μελέτη δεν μπορεί επίσης να δείξει αν το φάρμακο έφτασε στους στόχους του και απέτυχε ή απλώς δεν αλληλεπίδρασε ποτέ με αυτούς σε αυτή τη δόση. Δοκιμάστηκε μόνο μία δόση.

Οι ίδιοι οι συγγραφείς επισήμαναν τον σημαντικότερο περιορισμό, ο οποίος ισχύει και προς τις δύο κατευθύνσεις. Το μοντέλο SOD1 G93A με υψηλό αριθμό αντιγράφων αναπαριστά καλά τη νόσο που προκαλείται από την τοξικότητα της SOD1, αλλά αυτή αποτελεί μικρό τμήμα της οικογενούς ALS και έχει διαφορετική βιολογία από τις περισσότερες σποραδικές περιπτώσεις. Πρότειναν την επανεξέταση υποψήφιων ουσιών σε μοντέλα θηλαστικών βασισμένα στην TDP-43. Έκτοτε, αυτή η πρόταση έχει γίνει πιο σύνθετη, επειδή οι συγγραφείς της μελέτης σε σκώληκες και ψάρια σημειώνουν ότι μια ξεχωριστή μελέτη του κυανού του μεθυλενίου σε ποντικούς με TDP-43 επίσης απέτυχε να βελτιώσει τις κινητικές εκβάσεις. Επομένως, μια ουσία μπορεί να εμφανίζει ισχυρή δράση σε ένα σύστημα TDP-43 και καμία σε ένα άλλο σύστημα TDP-43. Το σύστημα έχει εξίσου μεγάλη σημασία με το γονίδιο.

Γιατί η βελτίωση σε σκώληκα ή ψάρι δεν μπορεί να τεκμηριώσει όφελος σε ασθενείς

Σκεφτείτε κάθε μοντέλο ως απάντηση σε διαφορετικό ερώτημα.

Πρώτον, η βιολογία διαφέρει. Οι TDP-43 και FUS είναι πρωτεΐνες που δεσμεύουν νουκλεϊκά οξέα και έχουν κοινές γενετικές αλληλεπιδράσεις σε αυτά τα απλά συστήματα, ενώ η τοξικότητα της SOD1 δρα μέσω εν μέρει διαφορετικών άμεσων μηχανισμών. Ένα φάρμακο που μετριάζει ένα είδος πρωτεοτοξικού στρες δεν είναι απαραίτητο να μετριάζει και το άλλο, και η επιτυχία απέναντι στην εμβρυϊκή υπερέκφραση δεν προβλέπει απαραίτητα επιτυχία απέναντι στη βραδεία νευροεκφύλιση των ενηλίκων, με φλεγμονή, συμμετοχή των γλοιακών κυττάρων και συστηματική επιδείνωση.

Δεύτερον, η έκθεση διαφέρει. Η συνεχής έκθεση μέσω λουτρού σε μικρομοριακές συγκεντρώσεις δεν είναι χορήγηση από το στόμα. Η εντερική απορρόφηση, ο μεταβολισμός πρώτης διόδου, η δέσμευση στις πρωτεΐνες του πλάσματος, η διείσδυση στον εγκέφαλο και η κάθαρση μεσολαβούν μεταξύ μιας δόσης που καταπίνεται και ενός κινητικού νευρώνα του νωτιαίου μυελού. Καμία από τις δύο μελέτες δεν μέτρησε τα επίπεδα του φαρμάκου στο νευρικό σύστημα, οπότε καμία δεν μπορεί να συσχετίσει τη συγκέντρωσή της με εκείνη της άλλης.

Τρίτον, ο χρόνος έναρξης διαφέρει. Τα οφέλη στους σκώληκες και στα ψάρια εξαρτιόνταν σε μεγάλο βαθμό από την αγωγή πριν συσσωρευτούν οι παθολογικές αλλοιώσεις. Η αγωγή στους ποντικούς ξεκίνησε επίσης πριν από τα συμπτώματα, κάτι που αποτελεί πλεονέκτημα, αλλά η αγωγή σε ανθρώπους θα ξεκινούσε σχεδόν πάντα μετά την εμφάνιση των συμπτωμάτων, δηλαδή ακόμη αργότερα. Μια ένδειξη προφυλακτικής δράσης σε δοκιμασία εμβρύων διάρκειας δύο ημερών αποτελεί αφετηρία για έρευνα, όχι μοντέλο κλινικής χρήσης.

Τέταρτον, τα καταληκτικά σημεία διαφέρουν. Η παράλυση στις 12 ημέρες, η ευαισθησία στο aldicarb, το μήκος των αξόνων σε μικρόμετρα και η απόσταση κολύμβησης είναι φαινότυποι που βρίσκονται κοντά στον υπό μελέτη μηχανισμό. Η έναρξη και η επιβίωση σε ένα θηλαστικό ενσωματώνουν κάθε αντισταθμιστική και επιπλέκουσα διαδικασία στο σώμα. Τα φάρμακα συχνά μεταβάλλουν δείκτες κοντά στον μηχανισμό χωρίς να μεταβάλλουν την επιβίωση, και γι’ αυτό χρησιμοποιούνται καταληκτικά σημεία χρόνου έως ένα συμβάν σε θηλαστικά.

Οι αναγνώστες που θέλουν μια λίστα ελέγχου για τον επόμενο τίτλο μπορούν να χρησιμοποιήσουν εκείνη από το άρθρο πώς να διαβάζετε προκλινικές μελέτες: εξετάστε το είδος, το διαγονίδιο, τη δόση και την οδό χορήγησης, αν μετρήθηκαν επίπεδα του φαρμάκου, πότε ξεκίνησε η αγωγή σε σχέση με την παθολογία, αν το καταληκτικό σημείο ήταν ένας βραχυπρόθεσμος φαινότυπος ή η πορεία μιας νόσου, και αν η επίδραση αναπαράχθηκε σε δεύτερο εργαστήριο. Το ευρύτερο σύνολο τεκμηρίων από ανθρώπους για το κυανό του μεθυλενίου παραμένει το σημείο αναφοράς για να ελέγξετε αν κάποια από αυτές τις πρώιμες ενδείξεις εξελίχθηκε σε κλινικά δεδομένα.

Τι σημαίνει αυτό για τους ασθενείς και τις οικογένειες

Από αυτές τις δημοσιεύσεις δεν προκύπτει κανένα καθιερωμένο πρωτόκολλο κυανού του μεθυλενίου για την ALS. Η θετική μελέτη υποστηρίζει περαιτέρω έρευνα στους οξειδωτικούς και συναπτικούς μηχανισμούς της βιολογίας των TDP-43 και FUS. Η μελέτη με μηδενικό αποτέλεσμα αποδυναμώνει την προσδοκία τροποποίησης της νόσου από χρόνια χορήγηση από το στόμα σε αυτό το επίπεδο έκθεσης σε νόσο τύπου SOD1. Μαζί περιγράφουν ασυνέπεια μεταξύ μοντέλων, όχι σύσταση θεραπείας.

Η ασφάλεια αξίζει την ίδια νηφάλια αντιμετώπιση με την αποτελεσματικότητα. Οι μελέτες ALS σε ποντικούς δεν λένε τίποτα για ασφαλή δοσολογία σε ανθρώπους, και το κυανό του μεθυλενίου ενέχει πραγματικούς κινδύνους λόγω αιμόλυσης σε ανεπάρκεια G6PD και λόγω τοξικότητας σεροτονίνης όταν συνδυάζεται με σεροτονινεργικά φάρμακα. Η υποψία ανεπάρκειας G6PD, η τρέχουσα χρήση αντικαταθλιπτικών και οποιαδήποτε προγραμματισμένη αλλαγή φαρμακευτικής αγωγής πρέπει να συζητούνται με γιατρό, όπως και η εξέταση των γενικών δεδομένων ασφάλειας του κυανού του μεθυλενίου πριν κάποιος ενεργήσει βάσει τίτλων για εργαστηριακά ευρήματα.

Το βασικό συμπέρασμα χωρά σε μία πρόταση. Το κυανό του μεθυλενίου προκάλεσε ισχυρή αποκατάσταση με πρώιμη έκθεση στους φαινοτύπους σκωλήκων και προνυμφών ψαριών με TDP-43 και FUS, αλλά ουσιαστικά κανένα όφελος ως προς την έναρξη ή την επιβίωση σε μελέτη χρόνιας χορήγησης από το στόμα σε ποντικούς με SOD1, επομένως η έντιμη ερμηνεία είναι ότι πρόκειται για τεκμήρια εξαρτώμενα από το μοντέλο, τα οποία δεν υποστηρίζουν τη χρήση σε ασθενείς.